張婧，黃琳凱＊，ZHAO Bing－yu，張新全，嚴(yán)海東，蔣曉陽

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安625014；2.弗吉尼亞理工大學(xué)，美國 弗吉尼亞州VA 24061）

柳枝稷 （Panicum virgatum）是一種高大的多年生草本C4植物，具有適應(yīng)性廣、生物質(zhì)產(chǎn)量高和對環(huán)境友好等優(yōu)點，在生態(tài)改良和新能源開發(fā)方面潛力巨大［1］。開發(fā)清潔可再生的生物質(zhì)能源意義深遠，美國能源部將柳枝稷作為纖維素類能源植物中的模式植物，而我國對柳枝稷的應(yīng)用和研究尚處于起步階段，選育適合我國栽培的柳枝稷品種可加快能源植物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

品種選育和改良可有效提高其能量轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟效益，而分子育種可大大加快柳枝稷的育種進程。雜種鑒定是遺傳育種的基礎(chǔ)工作之一，鑒定出的真雜種可為雜交育種和遺傳圖譜構(gòu)建等提供重要依據(jù)。柳枝稷是異花授粉多倍體植物［2］，在雜交過程中由于隔離不嚴(yán)或者具有一定的自交率等原因，不同來源花粉可導(dǎo)致種子生物學(xué)混雜，因此對雜交后代的真實性鑒定十分必要。分子標(biāo)記技術(shù)由于具有快速簡便，可以實現(xiàn)高通量等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各種植物的雜種鑒定和雜種純度分析工作中，如柚（Citrus maxima）［3］，辣椒（Capsicum annuum）［4］，棗（Ziziphus jujuba）［5］等。其中簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、結(jié)果可靠、重復(fù)性好的特點，在雜種鑒定，遺傳多樣性研究，遺傳圖譜構(gòu)建等方面應(yīng)用廣泛［6－9］。表達序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ESTs）的發(fā)展促進了SSR的應(yīng)用，并且快速增長的ESTs數(shù)據(jù)已成為SSR標(biāo)記的重要開發(fā)來源。與基因組SSR相比，EST－SSR的開發(fā)不需要構(gòu)建DNA文庫及克隆測序等步驟，更為節(jié)省成本和時間［10］。2001年美國加州大學(xué) Li和 Quiros［11］發(fā)明了相關(guān)序列擴增多態(tài)性（sequence－related amplified polymorphism，SRAP）技術(shù)，是一種新型的基于PCR的隨機引物標(biāo)記系統(tǒng)。SRAP屬于顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性高，操作簡便等優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛運用于遺傳多樣性分析和雜種鑒定工作中，如多花黑麥草（Lolium multiflorum）［12］、結(jié)縷草（Zoysia japonica）［13］、紫花苜蓿（Medicago sativa）［14］、柱花草（Stylosanthes guianensis）［15］等植物。但是這2種分子標(biāo)記在柳枝稷雜種鑒定中的比較分析，尚未見報道。

本研究分別利用SRAP和SSR標(biāo)記技術(shù)對柳枝稷165個雜交后代進行雜種真實性鑒定，分析顯性標(biāo)記SRAP與共顯性標(biāo)記SSR在雜種鑒定中的擴增多態(tài)性以及鑒定準(zhǔn)確性和效率，為應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定柳枝稷乃至異花授粉多倍體植物的雜種真實性提供依據(jù)，且鑒定得到的真雜種可以用于構(gòu)建柳枝稷遺傳圖譜、重要性狀的QTL定位等研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

親本Alamo和Dacotah，以及以Alamo為父本，Dacotah為母本雜交得到的165株F1植株，編號為DAT1～DAT165。雜交后代和親本均盆栽于溫室中。其中Alamo屬于低地生態(tài)型，植株較高大，莖稈粗壯；Dacotah屬于高地生態(tài)型，莖稈較細，分枝較多。

1.2 基因組DNA提取

本實驗于2010年4月進行。以柳枝稷幼葉為材料，采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根公司）提取DNA。提取的DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行純度的檢測。將DNA樣品置于－20℃冰箱保存。待開始實驗時，將各個DNA樣品取出一部分稀釋至20ng／μL，放于4℃冰箱保存并備用。

1.3 SRAP分析

SRAP標(biāo)記引物序列見Li和Quiros［11］的報道。SRAP標(biāo)記共有上游引物12條，下游引物19條，兩兩組合為228對引物。用親本Alamo和Dacotah對SRAP引物進行父本特征帶的篩選。PCR擴增反應(yīng)體系為20μL：DNA 2μL（20ng／μL），2×Taq PCR MasterMix（天根公司）10μL，上下游引物各1μL（10μmol／L），滅菌水補齊20μL。

SRAP－PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，35℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，共5個循環(huán)；94℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，－20℃保存［16］。以上PCR反應(yīng)在PTC－200PCR（Bio－Rad）儀上進行。最后PCR擴增產(chǎn)物采用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，0.1mg／mL的溴化乙錠（EB）染色，120V電壓（5V／cm）在0.5×TBE緩沖液中電泳約1.5h，電泳結(jié)束后凝膠在凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad）中照相并保存。

1.4 SSR分析

柳枝稷EST－SSR標(biāo)記引物序列由Tobias等［17］提供，共30對引物。隨機選擇2個F1植株及雙親共4份材料的DNA對30對EST－SSR引物進行多態(tài)性篩選，選擇擴增條帶清晰、帶型穩(wěn)定，具有父本特征帶的引物，用于雜種鑒定。PCR反應(yīng)擴增體系20μL：DNA 2μL（20ng／μL），2×Taq PCR MasterMix（天根公司）10μL，上下游引物各1μL（10μmol／L），滅菌水補齊20μL。

EST－SSR PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。最后PCR擴增產(chǎn)物采用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，0.1 mg／mL的溴化乙錠 （EB）染色，120V電壓（5V／cm）在0.5×TBE緩沖液中電泳約1.5h，電泳結(jié)束后凝膠在凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad）中照相并保存。

1.5 雜種鑒定

對于顯性標(biāo)記SRAP分子標(biāo)記，F(xiàn)1擴增產(chǎn)物中具有父本特異條帶，則可鑒定為真雜種，若僅具有母本特異條帶，則需結(jié)合其他引物進行進一步分析；對于共顯性標(biāo)記SSR分子標(biāo)記，選取具有雙親互補型條帶的引物進行分析，F(xiàn)1擴增產(chǎn)物中具有父本特異條帶，則鑒定為真雜種，反之則為假雜種。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間具有多態(tài)性的SRAP引物篩選

對228對引物進行多態(tài)性條帶的篩選，選出在子代中多態(tài)性好，且具有父本特征帶的引物組合為：me1＋em7，me2＋em16，me2＋em5，me3＋em12，me7＋em13，me10＋em19，共6對。所選引物的多態(tài)性比率最大66.66%，最小為33.33%，平均為40.00%。

2.2 具有雙親互補帶型的EST－SSR引物篩選

從30對EST－SSR引物中，篩選出11對帶型穩(wěn)定并在雜種及親本間具有多態(tài)性的引物（表1），這些多態(tài)性引物中，primer23，primer79，primer793和primer995具有雙親互補帶型，引物的多態(tài)性條帶比率為100.00%。所選引物多態(tài)性比率最小為50.00%，平均為71.22%。

表1 11對SSR引物多態(tài)性統(tǒng)計結(jié)果Table 1 The polymorphism of 11pairs of SSR primers

2.3 雜種真實性鑒定

在用SRAP引物鑒定過程中，引物me1＋em7有69個F1植株的擴增圖譜中沒有出現(xiàn)父本特征帶（表2），繼而使用其余引物逐一鑒定，只要出現(xiàn)父本特征帶則判定為真雜種，若僅有母本特征帶則利用其他引物進一步分析。實驗中共使用6對引物鑒定了165個F1植株的真實性，DAT163在所用引物中均未出現(xiàn)父本特征帶，不能確認(rèn)是否為真雜種。引物me1＋em7的擴增圖譜見圖1。

在用EST－SSR引物鑒定過程中，僅使用1對引物，即primer23，就可以鑒別所有F1植株的真實性，體現(xiàn)了共顯性標(biāo)記SSR在雜種鑒定中的高效性。但是應(yīng)該選擇具有雙親互補性條帶進行雜種鑒定，如primer23，primer79，primer793和primer995，在父本Alamo中擴增帶型為ab，在母本Dacotah中擴增帶型為cd（primer23擴增效果見圖2）。鑒定結(jié)果為DAT163未出現(xiàn)父本特征帶，確認(rèn)其為假雜種，與SRAP鑒定結(jié)果基本相同。

2.4 柳枝稷雜種群體的SRAP與SSR標(biāo)記擴增產(chǎn)物多態(tài)性

利用6對SRAP引物對165個F1植株擴增，共得到20個條帶，平均每對引物得到3.3個條帶，其中多態(tài)性條帶共8條，平均每對引物1.3條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分比為40%。因此SRAP在雜交種中檢測的多態(tài)性百分比相對較低（表2）。

用SSR引物primer23擴增時，得到4個條帶均為多態(tài)性條帶，屬于雙親互補型，多態(tài)性條帶比率為100%（表2）。表明SSR標(biāo)記能夠檢測出較多的遺傳位點，獲得多態(tài)性高的PCR結(jié)果，鑒定效率更高。

圖1 引物me1＋em7對柳枝稷F1的SRAP檢測圖譜Fig.1 SRAP marker amplified with primer me1＋em7in the F1population

圖2 引物primer23對柳枝稷雜交種的SSR檢測圖譜Fig.2 SSR fingerprint amplified with primer pair No.primer23in switchgrass hybrids

3 討論

就準(zhǔn)確性而言，SSR與SRAP標(biāo)記的鑒定結(jié)果相同，都可用于柳枝稷的雜種鑒定工作，從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。但就鑒定效率而言，SSR分子標(biāo)記表現(xiàn)出了很大的優(yōu)勢。SRAP標(biāo)記是一種顯性標(biāo)記，在對雜種的真實性進行鑒定時，出現(xiàn)父本特異條帶就可以認(rèn)為是真雜種，而出現(xiàn)母本特異條帶時則不能說明是否為真雜種。顯性標(biāo)記只能肯定雜種的真實性，不能否定。同時，用多個引物才可以確定雜交種的真實與否。SSR是一種共顯性標(biāo)記，本研究中只用1對ESTSSR引物便鑒定出了165個雜種的真實性，表現(xiàn)出了EST－SSR在雜種鑒定工作中的高效率。在研究中用了6對SRAP引物才鑒別出165個F1植株的雜種真實性，因此共顯性的EST－SSR標(biāo)記在雜種鑒定工作中有獨特的優(yōu)勢，但要選擇在親本中高度多態(tài)的引物，最好是在親本間能擴增出4個不同的條帶，如引物primer23。

表2 SSR標(biāo)記與SRAP標(biāo)記鑒定結(jié)果Table 2 Identification of 165hybrids by SSR and SRAP markers

本研究中，SRAP標(biāo)記擴增條帶的多態(tài)性比率低于SSR標(biāo)記。SSR多態(tài)性產(chǎn)生主要是由于DNA復(fù)制和修復(fù)過程中堿基的滑動、錯配或減數(shù)分裂過程中姊妹染色單體的不均等交換，故多態(tài)性產(chǎn)生的幾率較高［18］。SSR為共顯性遺傳，每個位點具有多個等位基因，因此SSR標(biāo)記的期望異質(zhì)性比顯性標(biāo)記SRAP高。王華忠等［19］利用SRAP與SSR標(biāo)記分析不同類型甜菜（Beta vulgaris）的遺傳多樣性證實了這一點，在他的研究中，11對SRAP引物共擴增出199個條帶，其中86條具有多態(tài)性，多態(tài)性帶比率為43.7%，而SSR的9對引物共產(chǎn)生35條擴增帶，多態(tài)性比率為100%，遠遠高于SRAP。

EST－SSR不僅具備傳統(tǒng)基因組SSR標(biāo)記的優(yōu)點，而且開發(fā)簡單快捷，費用更低；ESTs來自轉(zhuǎn)錄區(qū)，保守性高，故其通用性較好；此外EST－SSR可直接和表達基因相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)連鎖的分子標(biāo)記之后，更容易克隆到目標(biāo)基因［20］。作為一種新的SSR標(biāo)記，EST－SSR標(biāo)記已經(jīng)在許多植物種類中得到應(yīng)用，例如葡萄（Vitis vinifera）、甘蔗（Saccharum officinarum）、小麥（Triticum aestivum）以及高羊茅（Festuca arundinacea）等物種［10］，但在雜種鑒定中的應(yīng)用報道較少。

目前報道的雜種鑒定研究多是基于單一分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果，本研究同時應(yīng)用SSR和SRAP標(biāo)記技術(shù)進行雜種鑒定，鑒定結(jié)果比單一標(biāo)記鑒定的結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠，為應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定柳枝稷乃至異花授粉多倍體植物的雜種真實性提供科學(xué)依據(jù)，且鑒定出的真雜種可用于柳枝稷遺傳圖譜的構(gòu)建及重要性狀的QTL定位，從而為柳枝稷分子標(biāo)記輔助育種的研究打下重要基礎(chǔ)。

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