史娟，王華榮，鐘少林

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021；2.西部土地退化與生態(tài)恢復(fù)國家重點實驗室培育基地，寧夏 銀川750021）

植物病原真菌引起寄主植物生病進而表現(xiàn)出癥狀，首先必須侵入寄主組織并在其體內(nèi)生長，才能完成其侵染過程。因此，病原菌為了成功侵入發(fā)展了一系列的入侵及最大限度生長、繁殖及主動入侵的機制［1］。伴隨寄主病原互作過程的發(fā)生，寄主和病原菌相應(yīng)的生理、生化、細(xì)胞及分子生物學(xué)過程隨之發(fā)生［2，3］。研究病原寄主兩者親和性互作的細(xì)胞學(xué)特征，從細(xì)胞角度闡明兩者互作機制，為進一步研究病菌致病的分子機理、信號識別等具有重要的理論意義。

苜蓿（Medicago sativa）作為一種優(yōu)質(zhì)飼草，是我國栽培面積最大的牧草之一［4］。因其特殊的固氮能力、較強的適應(yīng)性，國內(nèi)外學(xué)者從形態(tài)、細(xì)胞和分子生物學(xué)等方面進行了系統(tǒng)而深入的研究［5－8］。苜蓿褐斑?。ㄆ胀ㄈ~斑?。┦怯绍俎＜俦P菌（Pseudopeziza medicaginis）引致的葉部病害，廣泛分布于世界各主要苜蓿產(chǎn)區(qū)，是苜蓿生產(chǎn)中危害嚴(yán)重的葉部病害之一［9，10］。不僅造成牧草產(chǎn)量的損失，而且降低干草產(chǎn)品的品質(zhì)。病菌侵染葉片形成平均直徑約2mm的褐色圓形略突起的點狀病斑，導(dǎo)致苜蓿葉片香豆雌酚等植物雌激素樣物質(zhì)大量增加，常使得家禽采食后引起流產(chǎn)、不育等疾?。?1，12］。有關(guān)該病害的研究，最近的研究涉及細(xì)胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域，不僅闡明了苜蓿褐斑病菌的侵染過程［13，14］，而且獲得了一個與抗褐斑病基因相關(guān)的標(biāo)記—M3E3－R169［15］。標(biāo)志著苜蓿褐斑病的研究進入分子領(lǐng)域［16－18］。這些研究結(jié)果為苜蓿的抗病育種奠定了堅實的基礎(chǔ)。在苜?！俎＜俦P菌互作系統(tǒng)中，作者應(yīng)用細(xì)胞學(xué)方法研究了苜蓿假盤菌侵染苜蓿葉片的侵染過程［13］，但兩者親和性互作的超微結(jié)構(gòu)特征未見系統(tǒng)報道。本研究從病菌侵染以及感病寄主組織的細(xì)胞學(xué)反應(yīng)2個方面闡述兩者親和性互作的關(guān)系，為進一步闡明病菌侵入的分子機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試菌種、苜蓿品種及其培養(yǎng)、繁殖

苜蓿假盤菌由寧夏大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所提供。挑取平板上培養(yǎng)的苜蓿假盤菌菌落，制成菌落懸浮液，移入20%V8汁CaCO3培養(yǎng)基上擴繁。

供試感病苜蓿品種為德國大葉（M.sativa）由寧夏大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所提供，按常規(guī)方法種植于直徑為30 cm的花盆內(nèi)，待二茬苜蓿生長至3周左右，避開嫰葉和老葉，選取生長一致的功能葉片，用滅菌水沖洗2遍后，置于底部鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)待用。

1.2 接種

每皿放入10個苜蓿葉片，采用逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法進行接種。將V8培養(yǎng)基上成熟的苜蓿假盤菌菌落挑出，移至底部鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿蓋上，于20℃黑暗條件下保濕4～6h，取出置于離體苜蓿葉片的正上方，利用子囊自然彈射進行接種，接種2～4h后將接種菌落移出。重復(fù)3次。為了保證離體葉片上有足夠的游離水，不定期的用滅菌水對接種后的離體葉片進行噴霧。

1.3 透射電鏡（TEM）樣品的制備與觀察

分別于接種后24h、48h、5d（癥狀初顯）、10d（中顯）和15d（病斑突破寄主表皮產(chǎn)生子囊盤）取樣，并將樣品切成0.3～0.5cm2的小塊，按康振生［19］的方法制備樣品。葉樣經(jīng)抽真空后于4%戊二醛（磷酸緩沖液，pH 6.8，0.25mol／L）中前固定16h（4℃），緩沖液反復(fù)沖洗，于1%餓酸（磷酸緩沖液，pH 6.8，0.25mol／L）中后固定2h。系列丙酮脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，在40和60℃下分別聚合24和48h。樣塊進行修整后，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙重染色，于JEM－1230型透射電鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌侵入寄主的超微結(jié)構(gòu)特征

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，苜蓿假盤菌侵入寄主組織后，病菌菌絲在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生了一系列的變化。接種24～36 h，菌絲直接進入寄主細(xì)胞，以胞內(nèi)方式生長，并向相鄰的細(xì)胞擴展（圖1－1，2）。進入寄主胞內(nèi)的病菌菌絲有著較厚的外壁，且周圍沉積電子致密度高的物質(zhì)形成似菌絲鞘狀結(jié)構(gòu)將菌絲包裹，菌絲中可見占據(jù)面積較大的液泡，多個菌絲的菌絲鞘可相互連接，且隨菌絲的擴展而延伸（圖1－4，5），菌絲分隔處明顯觀察到菌絲細(xì)胞液在流動（圖1－2）。擴展的胞間菌絲細(xì)胞壁比胞內(nèi)菌絲明顯加厚（圖1－3）。菌絲在穿透臨近細(xì)胞時，菌絲外壁的某一個部位與寄主細(xì)胞壁緊密接觸，接觸點顏色加深，液泡移向接觸點似乎形成了較大的壓力幫助其穿過胞壁組織（圖2－7）。同時還觀察到，侵入寄主細(xì)胞內(nèi)的菌絲并不立即穿透寄主質(zhì)膜，而是利用質(zhì)膜將其包圍，質(zhì)膜突起部分沉積電子致密度高的物質(zhì)，該區(qū)域隨菌絲的擴展而延伸（圖2－9，10，12）。胞內(nèi)菌絲侵染葉綠體等細(xì)胞器時，菌絲鞘首先與葉綠體等細(xì)胞器膜相連（圖2－8，11），然后破壞和瓦解基粒片層結(jié)構(gòu)，被瓦解的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)沿菌絲和胞壁周圍沉積（圖3－14，15）。隨著菌絲的擴展，菌絲鞘和包裹菌絲的質(zhì)膜區(qū)域被降解（圖3－17），而不再具有完整性。

2.2 寄主細(xì)胞病理變化的超微結(jié)構(gòu)特征

超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，伴隨病菌成功侵入、定殖和擴展，寄主細(xì)胞出現(xiàn)了一系列的病理變化特征。首先病菌侵入寄主細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)擴展發(fā)育，寄主原生質(zhì)膜向內(nèi)凹陷并形成突起，將侵入到寄主細(xì)胞內(nèi)的菌絲包裹，菌絲與質(zhì)膜始終是隔離的，寄主原生質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間沉積電子致密度深的物質(zhì)，形成一個將病菌菌絲和寄主原生質(zhì)膜隔開的界面層（圖1－2，圖2－10，11），這一現(xiàn)象表明寄主細(xì)胞膜的完整性遭到了攻擊，但病菌并未對寄主細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生直接的破壞作用，從而使病原菌不斷地在原生質(zhì)膜區(qū)域擴展。其次是菌絲體在寄主細(xì)胞內(nèi)的不斷擴大，周圍的原生質(zhì)膜也相應(yīng)擴大其面積，始終將寄主原生質(zhì)與菌絲體隔開。由于苜蓿褐斑病菌大部分的菌絲都是在寄主細(xì)胞內(nèi)活動，因此，病菌和寄主細(xì)胞發(fā)生的一系列的營養(yǎng)、生物學(xué)及信號識別等都有可能發(fā)生在這一區(qū)域。當(dāng)病菌菌絲擴展至質(zhì)膜部位時，與其相鄰細(xì)胞細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)的質(zhì)膜沉積電子致密度高的物質(zhì)（圖3－13）。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，沿交界面的外層排列了多個不等的液泡狀物，有些是直接嵌入在界面層的組織內(nèi)（圖3－16）。隨著侵染時間的延長，寄主細(xì)胞內(nèi)葉綠體是最先被降解的細(xì)胞器，隨后才是質(zhì)膜的降解，多個細(xì)胞器被降解，降解物沉積在細(xì)胞壁和菌絲壁邊緣（圖3－19），在降解嚴(yán)重的寄主細(xì)胞內(nèi)，形成一些結(jié)晶狀的顆粒物（圖3－20），隨著病菌菌絲的不斷擴展，大量胞內(nèi)菌絲向胞外擴展，寄主完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，被病菌菌絲充滿（圖3－21）。

3 結(jié)論與討論

本研究利用電子顯微技術(shù)，研究了苜蓿假盤菌與苜蓿親和性互作過程的超微結(jié)構(gòu)特征，首次從細(xì)胞角度揭示了兩者互作細(xì)胞學(xué)機制。為從分子生物學(xué)角度對其進行更深入的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖1 侵入寄主細(xì)胞中的病菌菌絲的超微結(jié)構(gòu)特征Fig.1 The ultrastructure of hyphal to invade the host cells

圖2 病菌菌絲在寄主細(xì)胞中的擴展以及對寄主質(zhì)膜影響的超微結(jié)構(gòu)特征Fig.2 Mycelial expansion in host cells and the effects ultrastructure of host plasma membrane

圖3 病菌侵染過程中寄主細(xì)胞表現(xiàn)出超微結(jié)構(gòu)特征Fig.3 Ultrastructural features show during pathogen infect of host cells

在褐斑病菌侵入寄主細(xì)胞以及進一步的發(fā)育過程中，病菌菌絲穿透寄主細(xì)胞壁進入到寄主細(xì)胞內(nèi)，在其發(fā)育和擴展的過程中，被內(nèi)陷的寄主原生質(zhì)膜所包圍，于是病菌菌絲與寄主質(zhì)膜之間形成了一個較大的交界面，這一界面將病菌菌絲與原生質(zhì)隔開，但這一界面，并不是自始至終都是存在的。在侵染早期，這一界面將菌絲包圍，并隨病菌菌絲的擴展而相應(yīng)的也在擴大其面積，且多個菌絲的界面可以相互連接，且菌絲在擴展和侵染葉綠體等細(xì)胞器時，菌絲鞘首先與質(zhì)膜和細(xì)胞器膜相連形成界面層。初步分析，病菌獲取營養(yǎng)物質(zhì)、與寄主的相互識別、信息物質(zhì)的交流等都有可能發(fā)生在這一界面。隨著侵染強度的增加，這一界面被降解。筆者認(rèn)為，這一現(xiàn)象可以說明，病菌為了達到侵入且在胞內(nèi)定殖的目的，避免寄主細(xì)胞抵御病原侵染產(chǎn)生的防御反應(yīng)，或快速的細(xì)胞死亡，利用寄主原生質(zhì)膜形成交界面，將菌絲與寄主原生質(zhì)隔開，這一層界面基質(zhì)可能是苜蓿褐斑病菌侵入寄主細(xì)胞存在的一個活體營養(yǎng)階段。由于白粉菌和霜霉菌等活體營養(yǎng)型真菌形成吸器進入寄主細(xì)胞，在吸器外膜和寄主細(xì)胞膜的界面之間形成界面基質(zhì)將其分開，因此，界面基質(zhì)的形成是大多數(shù)活體營養(yǎng)型真菌與寄主形成的一種共有現(xiàn)象［20］。而在炭疽菌的研究中，由于炭疽菌與寄主互作界面存在界面基質(zhì)的現(xiàn)象，且與活體營養(yǎng)型真菌的界面基質(zhì)相似，因此，菜豆炭疽菌（Colletotrichumlindemuthianum）被認(rèn)為是具有活體和死體2個營養(yǎng)型階段的植物病原菌［21］。苜蓿假盤菌在侵入寄主后也具有和寄主原生質(zhì)膜形成界面基質(zhì)的階段，筆者根據(jù)電鏡觀察結(jié)果：苜蓿假盤菌在其侵染過程中，由于出現(xiàn)了一個類似與活體營養(yǎng)型真菌的界面基質(zhì)階段，這一階段與菜豆炭疽病菌形成的界面基質(zhì)也較類似，因此，初步認(rèn)為苜蓿假盤菌的營養(yǎng)類型為半活體營養(yǎng)型真菌。

定殖在寄主細(xì)胞內(nèi)的病菌菌絲，首先破壞的細(xì)胞器是葉綠體，這與robárová［14］報道的結(jié)果一致。隨后是膜的降解，伴隨質(zhì)膜的降解，寄主細(xì)胞逐漸被瓦解。這一結(jié)果從細(xì)胞學(xué)角度解釋了為什么感染褐斑病的苜蓿葉片光合速率下降的原因之一。南志標(biāo)等［22］研究了苜蓿褐斑病對牧草質(zhì)量和光合速率影響，褐斑病使苜蓿病葉中粗蛋白含量顯著降低，與健葉相比，其含量減少25%，葉片光合速率隨病害嚴(yán)重度的增加而降低。

病菌早期形成界面層，說明界面層中的電子致密度物質(zhì)可能與病菌的致病性有關(guān)。其次，隨病菌侵染強度增加，界面層外側(cè)排列了多個液泡狀物，并可見有的液泡狀物與界面層嵌合。初步分析它們可能與界面層的降解有關(guān)。這些沉積物及液泡狀物是受病菌誘導(dǎo)的還是寄主細(xì)胞早期的反應(yīng)，有待于深入研究。

致謝：本論文中的研究內(nèi)容在西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室完成，在此謹(jǐn)表謝意。

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