郭敏，馬彥軍，李毅

（甘肅農業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州730070）

簡單重復序列（SSR，simple sequence repeat）由Moore等于1991年創(chuàng)立，是一類由幾個堿基組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列，其長度一般較短，每單元長度在1～6bp，兩邊有保守的DNA序列［1］。SSR具有很多優(yōu)點，它具有高度的多態(tài)性，數(shù)量豐富、信息含量高和重復性好等特點，遵循孟德爾的遺傳規(guī)律同時具有共顯性的模式，而且對DNA的純度要求不高，這就大大減少了工作的復雜度。并且SSR標記覆蓋整個基因組，呈現(xiàn)多基因特點，表現(xiàn)為共顯性遺傳［2－5］。

需要引起注意的是在SSR引物的獲得途徑中，由于目前只建立了DNA文庫和cDNA文庫，因此對于其中大多數(shù)的物種獲取SSR引物是比較困難的，對于一些以往處于初步研究的樹種可以借鑒其近緣種甚至其他物種已開發(fā)的引物［6］，如柑橘屬（Citrus）的不同種［7］以及獼猴桃屬（Actinidia）的不同種的引物開發(fā)［8］。本試驗中首先通過楊樹（Populus）引物在柳樹（Salix）上的通用性探究旨在加速楊柳樹種遺傳育種學的研究進程。

山生柳（Salix oritrepha）為楊柳科柳屬多年生落葉直立小灌木，為我國特有種，主要分布于海拔3 000～3 700m的高山山脊、山坡、溝谷林緣，具有生長快，無病蟲害等特點［9］，山生柳不僅具有以灌護草、以灌育草的作用，還能有效控制水土流失、涵養(yǎng)水源、培育土壤，對于生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有著重要作用［10］。目前國內在分子方面對祁連山不同海拔梯度高寒植物的遺傳多樣性分析未見報道。因此本課題組在已進行的研究中，對祁連山脈的山生柳資源進行了較多研究，并對分布于祁連山西水生態(tài)站的山生柳進行了梯度式考察取樣并作了細致的群落調查［11，12］。本試驗試圖通過從楊樹引物中篩選適合山生柳的引物并通過優(yōu)化反應條件，建立山生柳SSR標記的反應體系和條件，分析山生柳的遺傳多樣性，為山生柳的進一步研究提供依據(jù)，并為保護和發(fā)展祁連山高寒植被提出科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取樣方法和SSR引物來源

本研究選擇山生柳分布較為廣泛的祁連山自然保護區(qū)西水生態(tài)站作為實驗點，該區(qū)極端最高氣溫40℃，極端最低氣溫－35℃，年降水量400.8mm，集中在6－9月，空氣相對濕度58%，年蒸發(fā)量3 878mm，平均日照時數(shù)2 879.8h，無霜期平均187d。該區(qū)土壤和植被因氣候差異而形成明顯的垂直分布帶，山地森林灰褐土和亞高山灌叢草甸土是森林適宜生長的土壤，山地森林灰褐土分布在海拔2 400～3 300m地帶，是喬木林的主要分布帶，混雜有山生柳。亞高山灌叢草甸土分布在海拔3 300～3 900m地帶，是山生柳的主要分布帶。

取樣時，首先在海拔2 800～3 500m范圍內設樣線，在各樣線上沿海拔梯度平均每50m設置16m×16m的樣地1塊，共9個樣地。然后在各樣地內，對山生柳進行取樣。每個梯度隨機采20個無病害的葉片作樣方，共9個海拔梯度，180個單株（表1），隨著海拔的升高，山生柳的形態(tài)也有顯著變化。引物來源（http：／／www.ornl gov／sci／ipgc／ssr＿resource.htm，USA），隨機抽取合成。采用改良后的CTAB法提取植物 DNA［13］，－20℃下保存。于2009年6月－2010年6月進行了研究。

表1 材料來源及生境特點Table 1 The origin of examined plants and their habitat characteristics

1.2 PCR擴增和成果檢測

PCR程序采用優(yōu)化后的山生柳20μL體系，其中含有2.5mmol／L Mg2＋1μL，0.10mmol／L濃度的dNTPs 1.5μL，0.5UTaq酶用量為1μL，20ng／μL DNA模板1μL，0.5μmol／L的上下游引物各2μL，10×Taq Buffer 2μL、ddH2O加至20μL。PCR的預擴增程序經(jīng)優(yōu)化后，94℃預變性5min，94℃變性30s，54℃（不同引物有不同的退火溫度）退火45s，72℃延伸30s，循環(huán)數(shù)30個，最后再72℃延伸10min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（200V穩(wěn)壓，2h）分離，銀染檢測［14］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

根據(jù)電泳結果，本研究用Amersham Pharmacia Biotech公司的Image Scanner電泳掃描分析對凝膠進行掃描，根據(jù)共顯性分子標記基因型分型的原則，對得到的圖譜進行分析。有帶記為1，無帶記為0［15］，采用Popgen 32軟件進行數(shù)據(jù)處理，該軟件的優(yōu)點是處理的數(shù)據(jù)量大，適合于等位酶數(shù)據(jù)處理也適合于SSR的數(shù)據(jù)處理，因為它能給出所研究的各群體之間的一些資料，如：多態(tài)位點百分率，群體間的遺傳距離及遺傳一致度等。

2 結果和分析

2.1 山生柳SSR擴增引物的篩選

通過對PCR擴增的各個引物結果進行直觀比較從而篩選出15條帶型穩(wěn)定，重復性高的最佳引物。利用這15對引物對山生柳的遺傳多樣性進一步分析。15個引物，共擴增出211條條帶，分子量50～2 000bp，不同引物擴增的多態(tài)性帶紋數(shù)目從8到22不等，形成了帶型豐富、片斷大小及其組合不同的電泳圖譜（圖2和圖3）。其中多態(tài)性條帶有176個，這說明了山生柳具有較高的遺傳多樣性。楊屬引物的多態(tài)性比例達到76.41%。47對引物中，有43對帶型穩(wěn)定清晰，通用性達91.1%（圖1），楊樹引物的多態(tài)性比例較好（表2），引物WPMS15的多態(tài)性比率達到了90%，而引物SHUKl23、SHUKl24、SHUK034的多態(tài)性比率甚至達到了100%。結果證明了楊屬植物的引物在山生柳SSR－PCR體系建設中通用性良好。

圖1 引物1～47為待篩選楊樹引物的擴增Fig.1 Primer 1－47for populus primer which were selected

表2 選用15對引物擴增的譜帶信息Table 2 The information on bands generated by 15SSRs

2.2 山生柳不同海拔梯度的遺傳多樣性分析

通過Popgen32計算得出的結果顯示各海拔梯度的shannon指數(shù)（I）的多態(tài)性在0.234 2～0.598 8，平均為0.419 2。Nei指數(shù)在0.146 0～0.434 2（表3），平均為0.279 6，2種指標都表明山生柳種群具有較高的遺傳多樣性［16］，而且隨著海拔梯度的升高遺傳多樣性呈現(xiàn)升高的趨勢。不同海拔梯度間的Gst和Nm，總的遺傳多樣性Ht＝0.282 2，種群內遺傳多樣性 Hs＝0.255 8，Gst＝0.093 5，即9.35%的遺傳變異存在在居群間，90.55%的遺傳變異存在居群內（表4）。不同引物其遺傳分化系數(shù)所占的比例不同，其中ORPM－030最高，占到25.39%，引物SHUK034最低，為4.64%（表4）?；诜N群間遺傳分化系數(shù)計算的基因流為Nm＝4.848 7＞1，這說明居群間有較高水平的基因流，足以防止遺傳漂變所導致群居間的遺傳分化。圖2和圖3顯示了不同引物在山生柳擴增中的多態(tài)性，不同引物形成了8～22的帶型豐富及重復性好的電泳圖譜。同時觀察到楊樹引物能很好的顯示物種的遺傳分化情況，可以方便的鑒定物種的遺傳多樣性。

表3 甘肅祁連山不同海拔梯度山生柳的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity analysis of different latitudes of S.oritrepha

圖2 引物ORPM－030在不同海拔山生柳中的擴增結果Fig.2 SSR amplification results of S.oritrepha with primer ORPM－030

2.3 山生柳不同海拔梯度的遺傳距離和遺傳一致度

9個海拔梯度具有較高的遺傳一致度平均為0.943 7（表5），其中海拔梯度P9和P8相似系數(shù)最高，為0.999 7，海拔梯度越高，遺傳多樣性越高，具有較多相同的遺傳物質。9個海拔梯度的遺傳距離平均為0.029 6，海拔梯度P8和P9的遺傳距離最小，同樣說明高海拔的山生柳就有較高的遺傳多樣性。

表4 甘肅省祁連山不同海拔梯度山生柳種群的遺傳分化Table 4 Genetic differentiations among nine altitudes of S.oritrepha

表5 不同海拔梯度山生柳遺傳一致度和遺傳距離Table 5 Genetic identity and distance between different altitude of S.oritrepha

2.4 山生柳9個不同海拔的聚類分析

根據(jù)種群間的遺傳距離，采用類平均法（UPGMA）對9個種群進行聚類繪圖（圖4），大體分為3類群，P2首先和P3相聚，再與P1，P5相聚為一類。P6和P7相聚再與P4聚為第2類群，最后P8與P9聚為第3類群。Mantel檢驗結果表明，遺傳距離與空間地理距離有顯著相關性。

3 結論與討論

3.1 楊柳引物擴增的通用性

在SSR標記中多態(tài)性非常高，信息量豐富，而引物的變異度大，只要開發(fā)出合適的特異引物，檢測分析就變得簡單易行，因而SSR標記在遺傳多樣性分析中有很高的應用價值［17，18］。但SSR標記兩端序列保守，所以設計的引物必須考慮與兩端保守序列互補［19］，這使SSR標記的進行有一定的困難［20］?，F(xiàn)有的SSR標記數(shù)量有限，所以不能標記所有的功能基因，為了對某種植物進行SSR標記，就必須設立與該植物或相近物種的特定引物［21］。楊樹作為林木中的優(yōu)勢樹種，成為第3個完成基因組測序的物種，所以其SSR引物應充分被利用。本實驗中通過楊柳引物通用性的探究，不僅可以有效彌補柳樹分子標記不足的現(xiàn)狀，替代在柳樹中重新開發(fā)標記，節(jié)約引物開發(fā)成本，而且豐富其標記的數(shù)量。今后可在柳樹SSR實驗上采用楊屬引物，從而節(jié)省時間和成本。尤其本實驗中引物SHUKl23、SHUKl24、SHUK034的多態(tài)性比率達到了100%，充分證明了楊柳引物的通用性很好。

圖4 甘肅祁連山9個海拔梯度山生柳種群的遺傳聚類圖Fig.4 Dendrogram of nine latitudes of Gansu S.oritrepha

3.2 山生柳不同海拔居群的遺傳分化

通過SSR實驗結果顯示山生柳具有較高的遺傳多樣性，多態(tài)性條帶比率在50%以上被認為遺傳多樣性是豐富的［22］。表明該物種還未產(chǎn)生自交衰退現(xiàn)象。當種群Nm＞1時，存在一定的基因漂流，它能足以抵制遺傳漂變導致群居間的遺傳分化。在本試驗中，Wright［23］認為當Nm＝4.8487＞1，屬于較高水平，說明不同居群間存在一定的基因流動，可以防止由遺傳漂變引起的亞種群之間的遺傳分化，其可能為：1）山生柳具有有性繁殖與無性繁殖的雙重性，北方風沙大，花粉與種子可以隨處傳播。2）其種群有著一定的克隆生長，一定年齡的基株（個體）可形成多個克隆分株，進而構成高寒灌叢平。根據(jù)結果顯示隨著海拔梯度的升高，山生柳的遺傳多樣性有所增大，這可能與一定的氣候，溫度相關聯(lián)。

在群落中，由于生境梯度與物種的生物學特征的不同，經(jīng)常會出現(xiàn)：1）群落中物種交錯重疊，呈現(xiàn)極為復雜的關系。2）群落中物種相互不發(fā)生交錯關系，呈現(xiàn)明顯的分布界限。3）群落中某一個或幾個物種生態(tài)適應性較寬一些，但是其他物種（或類型）由于生境梯度的急劇變化，而被嚴格限制在某種生境中［24］。在聚類圖4中出現(xiàn)了一定情況的交錯現(xiàn)象，說明在一定海拔處呈現(xiàn)出明顯的生態(tài)交錯區(qū)。保護現(xiàn)存自然種群以保存盡可能多的遺傳多樣性是適宜的保護措施［25］，生境適宜促進物種進化，有利于物種長期生存發(fā)展，從另一方面證明山生柳對高寒氣候的適應性很強，這也是本試驗在不同海拔對山生柳遺傳多樣性進行探究的目的所在。根據(jù)計算得到的不同海拔梯度 Ht＝0.282 2，Hs＝0.255 8，Gst在0.046 4～0.253 9，平均為0.093 5，即4.64%～25.39%的遺傳變異存在于居群間，74.76%～95.26%的遺傳變異存在于居群內。山生柳以有性繁殖為主，但是，由于山生柳分布于寒帶氣候如：高山、亞高山、山地寒溫針葉林帶和冰雪帶之間，具有長期積雪、風大、低溫、干燥等氣候特點。因此，在惡劣的環(huán)境下，山生柳有性繁殖受到極大限制，因而主要依靠無性繁殖來維持其穩(wěn)定。

山生柳聚類分析結果與形態(tài)學觀察特征基本一致，即說明了遺傳本質差異對外部形態(tài)特征的對應反應［26］。從另一方面證實SSR標記穩(wěn)定可靠，可以利用標記進行物種的遺傳多樣性的分析。在祁連山脈隨著海拔的升高呈現(xiàn)出錦雞兒和山生柳叢生的情況，個體數(shù)較多也有利于傳粉和繁殖，干擾少從而資源保護很好，山生柳自身在惡劣的環(huán)境下積累了較多的遺傳變異，以適應各種環(huán)境變異，例如隨著海拔的升高山生柳葉片蠟質增多，葉片變小而厚等。上述結果均表明，群體分布的海拔和緯度差異，一定程度上造成了天然山生柳的分化。同時在本次研究中，也存在一定的限制性因素，由于取樣范圍有限，今后的研究中應擴大采集樣地，如甘肅省的山丹、蘇南、榆中、青海和四川［27］，力求進一步揭示山生柳種群生態(tài)學特征及其遺傳多樣性。

結合本研究的結果建議從以下幾方面對山生柳資源進行保護：1）就地保護好現(xiàn)有資源，禁止破壞生境，防止過度的放牧導致山生柳銳減，維護好小環(huán)境，建立自然保護區(qū)，對山生柳進行監(jiān)護。2）今后擴大采樣范圍，從分子方面探討山生柳遺傳漂變對其分布的影響。進一步揭示山生柳的遺傳多樣性。3）利用組織培養(yǎng)和扦插繁殖擴大其栽培面積，最大效益的實現(xiàn)其經(jīng)濟，生態(tài)價值。

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