李鴻雁，李志勇＊，師文貴，蔡麗艷，張靜萍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所 農(nóng)業(yè)部沙爾沁牧草資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測試驗(yàn)站，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010；2.內(nèi)蒙古大學(xué)交通學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021）

苜蓿屬扁蓿豆植物在內(nèi)蒙古境內(nèi)有1個(gè)正種、3個(gè)變種，即扁蓿豆（Medicago ruthenica）、細(xì)葉扁蓿豆（M.ruthenicavar.oblongifolia）、遼西扁蓿豆（M.ruthenica var.liaosiensis）和陰山扁蓿豆（M.ruthenica var.inschanica）［1］。從形態(tài)分類上目前有學(xué)者在內(nèi)蒙古發(fā)現(xiàn)扁蓿豆新類型，即野生黃花型扁蓿豆［1］。扁蓿豆是苜蓿遺傳改良的重要優(yōu)異基因來源，具有重要的利用價(jià)值。近年來國家牧草種質(zhì)中期庫收集、保存、鑒定評(píng)價(jià)了210份野生扁蓿豆種質(zhì)資源，對(duì)篩選出的優(yōu)良材料從形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞水平和DNA水平進(jìn)行遺傳多樣性的系統(tǒng)研究。

SSR和ISSR等技術(shù)已先后應(yīng)用于該植物的遺傳多樣性研究［2－6］，基于DNA－PCR的分子標(biāo)記技術(shù)已成為形態(tài)學(xué)之外的主要分析手段之一。不同分子標(biāo)記在遺傳多樣性研究中表現(xiàn)出各自的特性。選擇合適的分子標(biāo)記對(duì)能否客觀反映研究對(duì)象的狀況具有重要影響。ISSR（inter－simple sequence repeat）是一種利用重復(fù)序列加選擇性堿基為引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記［6］，ISSR引物序列長，退火溫度高，特異性和穩(wěn)定性增強(qiáng)，可檢測到更豐富的遺傳變異。ISSR技術(shù)在一些重要的牧草，如無芒雀麥（Bromus inermis）、昆侖錦雞兒（Caragana polourensi）、小花棘豆（Oxytropis glabra）和新麥草（Psathyrostachys juncea）的遺傳多樣性分析方面取得了很大進(jìn)展［7－10］。Martin和Sanchez－Yelamo［11］研究表明ISSR標(biāo)記與形態(tài)學(xué)、生化及其他分子標(biāo)記存在較高一致性。SSR（simple sequence repeat）是目前應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一，具有理想分子標(biāo)記絕大多數(shù)的優(yōu)良特點(diǎn)，且苜蓿屬SSR引物在種屬間具有一定通用性［12］，近年來，微衛(wèi)星技術(shù)廣泛應(yīng)用于披堿草（Elymus dahuricus）、鴨茅（Dactylis glomerata）、苜蓿（Medicago sativa）、錦雞兒屬（Caragana）等牧草的遺傳多樣性分析中［13－16］。本研究選取二倍體的黃花型扁蓿豆、細(xì)葉扁蓿豆和扁蓿豆為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)ISSR和SSR標(biāo)記在扁蓿豆種質(zhì)資源研究的可應(yīng)用性進(jìn)行探討，并結(jié)合種間關(guān)系分析比較兩者的標(biāo)記效率和多樣性檢測能力。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為6份黃花型扁蓿豆、2份細(xì)葉扁蓿豆和6份扁蓿豆，均為國家牧草中期庫課題組野外考察收集的材料，原產(chǎn)內(nèi)蒙古（表1）。于2006年種植在農(nóng)業(yè)部沙爾沁牧草資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測試驗(yàn)站。經(jīng)田間形態(tài)鑒定評(píng)價(jià)后，分別于2008年和2009年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家農(nóng)作物種質(zhì)資源保存中心實(shí)驗(yàn)室及國家牧草種質(zhì)中期庫分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行SSR和ISSR標(biāo)記分析。

表1 14份扁蓿豆種質(zhì)來源及編號(hào)Table 1 The code and origin of the 14accessions of M.ruthenica

1.2 PCR擴(kuò)增

1.2.1 DNA提取 每份材料隨機(jī)選取30個(gè)單株的新鮮葉片，用SDS法略加改進(jìn)提取每個(gè)單株葉片基因組DNA。

1.2.2 ISSR擴(kuò)增和檢測 參考加拿大哥倫比亞大學(xué)提供的二核苷酸重復(fù)ISSR引物中篩選出多態(tài)性豐富的18個(gè)引物（表2），對(duì)14份材料420個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25μL PCR反應(yīng)體系：模板DNA 0.5ng／μL，10×buffer（含 Mg2＋）2.0mmol／L，TaqDNA聚合酶1.5U，dNTPs 0.6mmol／L，引物0.9μmol／L。PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，50℃復(fù)性45s，72℃延伸1.5min，循環(huán)35次；72℃延伸10min，4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，電極緩沖液為1×TAE，電泳時(shí)間40min，用DL2000作對(duì)照。電泳結(jié)束后觀察照相。ISSR引物、dNTPs及TaqDNA聚合酶均購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2.3 SSR擴(kuò)增和檢測 根據(jù)Bernadette等［17］的報(bào)道，從89對(duì)紫花苜蓿和截形苜蓿SSR引物中篩選多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的18對(duì)引物進(jìn)行扁蓿豆PCR擴(kuò)增（表2）。PCR反應(yīng)體系為25μL：模板DNA 3μL，10×Buffer（含 Mg2＋）5.5μL，Taq DNA聚合酶（由北京天根生物公司合成）0.5μL，dNTP 0.75μL，引物（10mmol／L）0.75μL，ddH2O 14.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性25s，55～66℃（根據(jù)不同引物而定）退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（恒功率80W，30min）后，進(jìn)行銀染、固定、染色和顯影。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以清晰可辨的擴(kuò)增條帶在相對(duì)遷移位置的有無記數(shù)，有擴(kuò)增帶時(shí)，賦值為“1”，無擴(kuò)增帶時(shí)賦值為“0”，生成分子數(shù)據(jù)矩陣。利用Popgen 3.2統(tǒng)計(jì)SSR數(shù)據(jù)和ISSR數(shù)據(jù)的遺傳相似系數(shù)（GS），Shannon指數(shù)、Nei’s指數(shù)，利用 NTSYSpc 2.1軟件［18］采用 UPGMA （Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）法進(jìn)行聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀聚類圖，用Mantel檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性檢測。

表2 ISSR和SSR的引物序列Table 2 The prime sequences of ISSR and SSR

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增結(jié)果的多態(tài)性分析

18個(gè)ISSR引物可擴(kuò)增出清晰而重復(fù)性好的條帶，且具多態(tài)性，18對(duì)紫花苜蓿和截形苜蓿SSR引物可擴(kuò)增出清晰譜帶，對(duì)14份扁蓿豆材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

14份扁蓿豆的ISSR擴(kuò)增結(jié)果見圖1和表3，ISSR擴(kuò)增出的條帶共143條，條帶的分子量范圍為250～2 000 bp，其中多態(tài)性條帶125個(gè)，多態(tài)性比率平均為87.08%，不同引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)為5～11，平均為6.94條。多態(tài)性比率變幅為66.67%～100%，差異較大。

14份扁蓿豆的SSR擴(kuò)增結(jié)果見圖1和表3，18對(duì)SSR引物共擴(kuò)增到136個(gè)條帶，SSR擴(kuò)增帶的分子量為70～300bp，其中多態(tài)性條帶109個(gè)，多態(tài)性比率平均為80.09%。不同引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)為3～13，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出的片段條帶數(shù)為6.06條。不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性也存在較大的差異，每個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)性片段的百分率介于60.0%～100%。

Shannon指數(shù)和Nei’s指數(shù)既可以反映條帶的豐富程度，又可以反映均勻程度，而豐富度與均勻度是衡量多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)。Nei’s指數(shù)估算的18個(gè)ISSR引物和18對(duì)SSR引物擴(kuò)增所得位點(diǎn)的種群內(nèi)和種群間的基因多樣性，不同位點(diǎn)對(duì)遺傳多樣性的貢獻(xiàn)不同，SSR的Nei’s指數(shù)為0.284，平均Shannon指數(shù)0.438，種群內(nèi)基因多樣性為0.284，遺傳分化系數(shù)為0.674，ISSR的Nei’s指數(shù)為0.352，平均Shannon指數(shù)為0.522，種群內(nèi)基因多樣性為0.352，遺傳分化系數(shù)為1.000（表3）。

2.2 遺傳相似性分析

SSR分析結(jié)果表明，利用18對(duì)SSR引物產(chǎn)生的109條DNA片段計(jì)算了供試材料間的遺傳相似系數(shù)（GS）。SSR標(biāo)記揭示的材料間GS值變化范圍為0.669 7～0.885 3，SSR數(shù)據(jù)結(jié)果：遺傳相似系數(shù)（GS）最小的是來自內(nèi)蒙古呼和浩特市的6號(hào)黃花扁蓿豆材料和內(nèi)蒙古通遼市3號(hào)黃花扁蓿豆材料（0.669 7），遺傳距離最遠(yuǎn)，遺傳相似程度最低；最大的是來自內(nèi)蒙古包頭市達(dá)茂旗的14號(hào)扁蓿豆材料和來自內(nèi)蒙古赤峰市的12號(hào)扁蓿豆材料（0.885 3），遺傳距離最近，遺傳相似程度最高。

ISSR分析結(jié)果表明，利用18個(gè)ISSR引物產(chǎn)生的125條DNA片段計(jì)算了供試材料間的遺傳相似系數(shù)（GS）。ISSR標(biāo)記揭示的材料間GS值變化范圍為0.447 6～0.811 2，ISSR數(shù)據(jù)結(jié)果：遺傳相似系數(shù)（GS）最小的是來自內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣13號(hào)的扁蓿豆材料與內(nèi)蒙古錫林郭勒盟錫林浩特市的9號(hào)扁蓿豆材料（0.447 6），遺傳距離最遠(yuǎn)，遺傳相似程度最低；最大的是來自內(nèi)蒙古包頭市達(dá)茂旗的14號(hào)扁蓿豆材料與內(nèi)蒙古呼和浩特市的6號(hào)黃花扁蓿豆材料（0.811 2）；遺傳距離最近，遺傳相似程度最高。2種標(biāo)記所得結(jié)果基本相似。

圖1 UBC854（A）及 MTIC272（B）擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Amplification results of UBC854（A）and MTIC272（B）

2.3 聚類分析

2.3.1 ISSR分析 根據(jù)以上對(duì)遺傳相似性的計(jì)算結(jié)果，獲得供試材料間的遺傳距離GD（GD＝1－GS），利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2，閾值在0.646將14份材料分為4大類。第一大類來自內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣13號(hào)的扁蓿豆材料；第二大類包括來自內(nèi)蒙古赤峰市的12號(hào)扁蓿豆材料及來自內(nèi)蒙古通遼市的11號(hào)扁蓿豆材料；第三大類包括來自內(nèi)蒙古海拉爾市的2號(hào)細(xì)葉扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古包頭市的4號(hào)黃花扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古呼和浩特市的8號(hào)黃花扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古呼和浩特市的6號(hào)黃花扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古包頭市達(dá)茂旗的14號(hào)扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古通遼市3號(hào)黃花扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古通遼市5號(hào)黃花扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古呼和浩特市的7號(hào)黃花扁蓿豆材料；第四大類包括內(nèi)蒙古錫林郭勒盟白音錫勒的1號(hào)細(xì)葉扁蓿豆、內(nèi)蒙古錫林郭勒盟錫林浩特市的9號(hào)扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西蘇旗的10號(hào)扁蓿豆材料。

表3 ISSR和SSR標(biāo)記的結(jié)果比較Table 3 Comparison of usefulness between ISSR and SSR markers

2.3.2 SSR分析 閾值在0.7將14份材料分為4大類（圖3）。第一大類來自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟白音錫勒的1號(hào)細(xì)葉扁蓿豆；第二大類包括來自內(nèi)蒙古海拉爾市的2號(hào)細(xì)葉扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古呼和浩特市的6號(hào)黃花扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古呼和浩特市的8號(hào)黃花扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古通遼市5號(hào)黃花扁蓿豆材料、通遼市的11號(hào)扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古通遼市7號(hào)黃花扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣13號(hào)扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古錫林郭勒盟錫林浩特市的9號(hào)扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古赤峰市的12號(hào)扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古包頭市達(dá)茂旗的14號(hào)扁蓿豆材料、內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西蘇旗的10號(hào)扁蓿豆材料；第三大類是來自內(nèi)蒙古通遼市的3號(hào)黃花扁蓿豆；第四大類是來自內(nèi)蒙古包頭市土右旗的黃花扁蓿豆。

圖2 14份扁蓿豆材料的ISSR聚類圖Fig.2 Dendrogram of 14 M.ruthenicagermplasm by ISSR

圖3 14份扁蓿豆材料的SSR聚類圖Fig.3 Dendrogram of 14 M.ruthenicagermplasm by SSR

2.4 2種標(biāo)記的Mantel檢驗(yàn)

通過Mantal測驗(yàn)進(jìn)行表型性狀歐式遺傳距離矩陣、SSR和ISSR標(biāo)記的遺傳距離矩陣之間的相關(guān)性分析（圖4）。結(jié)果表明，二者距離矩陣之間存在顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝0.019 6，t＝0.121 2證明重要的表型性狀能夠較準(zhǔn)確的反映出親緣相近的材料的遺傳變異。

圖4 扁蓿豆材料ISSR分析和SSR分析的關(guān)系Fig.4 The data relationship between ISSR and SSR of M.ruthenica

3 討論與結(jié)果

分子標(biāo)記的應(yīng)用性評(píng)價(jià)是開展遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)工作之一［19］。由于所用標(biāo)記技術(shù)和材料的不同，得出的結(jié)論不盡一致。扁蓿豆因其優(yōu)異的特性具有很大的利用潛力。本研究對(duì)收集到的不同生態(tài)型的扁蓿豆資源進(jìn)行了SSR和ISSR遺傳多樣性的分析，2種標(biāo)記均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，表明2種標(biāo)記在扁蓿豆植物種間分析是有效的?；赟SR和ISSR標(biāo)記的遺傳相似性系數(shù)及UPGMA聚類顯示分析的綜合結(jié)果來看，黃花扁蓿豆種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較廣，主要集中在同一個(gè)大的類群中，具有一定的同源性，親緣關(guān)系較近；ISSR標(biāo)記具有比SSR標(biāo)記更高的PPB值，說明前者比后者具有更高的標(biāo)記效率和有更多的多態(tài)性位點(diǎn)，說明SSR標(biāo)記在親緣物種間具有高度多態(tài)性，適于親緣關(guān)系較近種群的分析［20］。因此認(rèn)為ISSR標(biāo)記在14份扁蓿豆材料間的擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性主要由類群間的差異引起，SSR標(biāo)記可高效的檢測扁蓿豆種質(zhì)資源中具有較近親緣關(guān)系的種群的遺傳多樣性［21］。2種標(biāo)記的結(jié)果相對(duì)一致，Mental測驗(yàn)二者距離矩陣相關(guān)系數(shù)為r＝0.019 6，t＝0.121 2。SSR 標(biāo)記和ISSR標(biāo)記的綜合聚類分析表明，2種標(biāo)記可以針對(duì)不同的類群和不同育種目標(biāo)對(duì)野生扁蓿豆資源進(jìn)行有目的的改良和利用，從而擴(kuò)大扁蓿豆遺傳基礎(chǔ)，為扁蓿豆育種積累材料。本研究方法也可為今后扁蓿豆種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用和遺傳多樣性研究提供更為合理準(zhǔn)確的參考。

扁蓿豆分布環(huán)境的多樣性，導(dǎo)致扁蓿豆不同居群之間以及同一居群不同個(gè)體之間形態(tài)性狀變異的多樣性。扁蓿豆為苜蓿屬中的一個(gè)野生種，是改良和育成新品種的巨大基因庫，利用分子標(biāo)記開展多基因聚合育種是未來育種的前途所在，借助截形苜蓿等模式牧草的分子標(biāo)記研究成果，有助于盡快獲得豆科牧草的大量標(biāo)記和高密度圖譜。

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