薛德，肖亮，艾辛，鄧念丹，蔣建雄，覃靜萍，陳智勇，劉樹玲，易自力

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128）

五節(jié)芒（Miscanthus floridulus）系禾本科（Poaceae）芒屬（Miscanthus）的一個主要種，主要分布于亞洲東南部太平洋諸島至波利尼西亞等地區(qū)，在中國大陸主要分布于安徽、湖北、貴州、福建、江蘇、廣東、廣西、江西、湖南、海南等?。?］。早期關(guān)于五節(jié)芒的研究，主要集中在形態(tài)學(xué)分類、生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性、細(xì)胞學(xué)特征及生產(chǎn)應(yīng)用［1－12］等方面，近年來，由于五節(jié)芒具有生物質(zhì)產(chǎn)量高、燃燒充分、灰分低等特性被認(rèn)為極具開發(fā)潛力的能源植物而引起全世界廣泛的關(guān)注［2］。作為能源植物資源，五節(jié)芒遺傳多樣性研究是其開發(fā)和利用的基礎(chǔ)。近期已有一些關(guān)于五節(jié)芒遺傳多樣性方面的研究結(jié)果發(fā)表，但僅限于利用分子標(biāo)記對局部地區(qū)五節(jié)芒進行遺傳多樣性分析［13，14］。五節(jié)芒在自然界分布廣、易雜交，造成其遺傳背景復(fù)雜，利用不同標(biāo)記對全國范圍內(nèi)的五節(jié)芒進行遺傳多樣性評價，有利于更準(zhǔn)確地揭示其遺傳變異情況。因此，本研究利用表型性狀結(jié)合SSR分子標(biāo)記對采自中國各地的53份五節(jié)芒種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行評價，以揭示五節(jié)芒種群中的遺傳變異度，為五節(jié)芒種質(zhì)資源的合理保護和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本項目組曾對中國的五節(jié)芒野生種質(zhì)資源的分布狀況進行了系統(tǒng)的調(diào)查，并從不同地區(qū)收集了202份五節(jié)芒種質(zhì)資源，保存在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物種質(zhì)資源圃內(nèi)，并于2008年至2010年進行了3個年份的表型性狀測量。本研究從中選取53份材料進行表型性狀和SSR標(biāo)記遺傳多樣性研究。在SSR標(biāo)記分析中加入2份南荻（M.lutarioriparius）和2份芒（M.sinensis）等近緣種作為外類群，供試材料見表1。

1.2 表型性狀調(diào)查與分析

表型性狀調(diào)查和數(shù)據(jù)采集方法參考《牧草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［15］進行，每份材料隨機取5個單株進行測量，共測量25個表型性狀。包括株高（plant height）、旗葉長（flag leaf length）、旗葉寬（flag leaf width）、最大葉長（largest leaf length）、最大葉寬（largest leaf width）、葉片數(shù)（leaf number per tiller）、節(jié)數(shù)（node number per tiller）、第1節(jié)寬邊直徑（first node long axis）、第1節(jié)窄邊直徑（first node short axis）、單莖干重（dry weight per tiller）、含水量（moisture content）、花序長（panicle length）、主軸長（panicle main axis length）、一級花序數(shù)（first－class branch number of panicle）、二級花序數(shù)（second－class branch number of panicle）、三級花序數(shù)（thirdclass branch number of panicle）、芒長（awn length）、基盤毛長（callus hair length）、穎長（grain length）、穎寬（grain width）、分蘗數(shù)（stem number per plant）、整株干重（dry weight per plant）、基部周長（basal circumference）、出苗－始花天數(shù)（days to 10%flowering）、出苗－種子成熟天數(shù)（days to seed maturity）。

表1 供試材料Table 1 Plant materials for this study

續(xù)表1 Continued

1.3 SSR分子標(biāo)記分析

1.3.1 總DNA提取 提取基因組總DNA所取材料均為剛長出的幼葉，采用改良CTAB法制備模板DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和濃度，并稀釋到20ng／μL，冷藏備用。

1.3.2 PCR擴增 本研究中選用了33對玉米（Zeamays）SSR引物和甘蔗（Saccharumofficinarum）ESTSSR引物，其中玉米SSR引物為Sigma－Aldrich產(chǎn)品（St.Louis，MO USA），而甘蔗EST－SSR引物序列由美國Illinois大學(xué)Erik Sacks博士提供，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成（表2）。PCR擴增在Biometra Tgradient PCR儀上進行。SSR－PCR反應(yīng)體系為15μL，含有10×PCR buffer 1.5μL、25mmol／L MgCl21.5μL、Primer 1.2μL、10mmol／L dNTPs 0.3μL、20ng／μL模板 DNA 2μL、5U／μL Taq酶0.1μL。以上試劑均購自廣州東盛生物技術(shù)有限公司。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，52～62℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進行表型性狀數(shù)據(jù)的方差分析、主成分分析（PCA）和聚類分析（UPGMA）。將SSR標(biāo)記清晰可辨的電泳條帶用于統(tǒng)計分析，在相同遷移率上，有擴增帶的賦值為1，無擴增帶的賦值為0。統(tǒng)計SSR擴增的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，計算多態(tài)性位點百分率（PPB，percentage of polymorphic bands），其中，PPB＝NPB／TNB，式中，NPB指多態(tài)性條帶數(shù)（NPB，number of polymorphic bands），TNB指擴增總條帶數(shù) （TNB，total number of bands）。采用 POPGENE version 1.31軟件計算 Shannon指數(shù)（I，Shannon’s information index，Lewontin［1972］）、基因多樣性指數(shù)（H，Nei’s［1973］gene diversity）、有效等位基因數(shù)（Ne，effective number of alleles），并計算引物多態(tài)性信息含量（PIC，polymorphism information content）。利用 NTSYS pc 2.1軟件計算SSR的遺傳相似系數(shù)，并利用UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀分析

2.1.1 表型性狀變異分析 對五節(jié)芒種質(zhì)資源的25個表型性狀進行統(tǒng)計分析結(jié)果表明（表3），性狀間變異系數(shù)的平均值為32.61±18.11，變化范圍為6.53（苗－種子成熟）～69.82（整株干重）。其中，變異幅度較大且變異系數(shù)在60%以上的性狀有3個：整株干重（69.82%）、三級花序數(shù)（65.78%）、二級花序數(shù)（64.76%）。25個表型性狀中整株干重變異最大，說明五節(jié)芒在生物質(zhì)產(chǎn)量上存在較大變異。三級花序數(shù)和二級花序數(shù)變化次之，說明五節(jié)芒花序分枝數(shù)適合作為一項分類依據(jù)來區(qū)分種內(nèi)不同種質(zhì)。25個表型性狀中變異系數(shù)最小的3個為：含水量（10.46%）、出苗至開花天數(shù)（6.98%）和出苗至種子成熟天數(shù)（6.53%）。五節(jié)芒含水量平均值達(dá)到54.59%，且種群內(nèi)變化幅度較小，印證了五節(jié)芒是宿根型常綠草本的生物特性。不同采集地緯度差別較大的五節(jié)芒野生種質(zhì)被移栽到同一地點后，通過觀察發(fā)現(xiàn)它們的生育期基本保持一致，集中在每年6、7月份開花。這一現(xiàn)象說明五節(jié)芒不易受光溫等環(huán)境因素的影響，為人工雜交育種提供了便利。除此之外，與產(chǎn)量密切相關(guān)的性狀如分蘗數(shù)（55.01%）、單莖干重（46.67%）和基盤周長（46.61%）也是變化較大的性狀，這些性狀的變化幅度大說明五節(jié)芒的產(chǎn)量及其產(chǎn)量構(gòu)成因子的可塑性強，通過雜交育種和合理的栽培管理措施能達(dá)到理想的選擇效果。

表3 五節(jié)芒種質(zhì)資源表型特征及變異Table 3 Morphological characteristics and variations in accession of M.floridulus

2.1.2 基于表型性狀的主成分分析與聚類分析 主成分分析表明（表4）特征值大于1的前7個主成分的累計貢獻率為74.908%。其中，第1主成分獨立貢獻率為13.909%，因子載荷最大的性狀是第1節(jié)寬邊直徑（0.890）和第1節(jié)窄邊直徑（0.885）；第2主成分獨立貢獻為12.710%，因子載荷最大的性狀是單株干重（0.872）、分蘗數(shù)（0.845）和基部周長（0.775）。第3主成分獨立貢獻率12.538%，因子載荷最大的性狀為三級花序數(shù)（0.829）、二級花序數(shù)（0.816）和一級花序數(shù)（0.759）；第4主成分獨立貢獻率10.881%，因子載荷最大的性狀為花序長（0.846）和主軸長（0.788）；第5主成分獨立貢獻率為9.244%，因子載荷最大的性狀是旗葉長（0.864）和旗葉寬（0.717）；第6主成分獨立貢獻率為9.083%，因子載荷最大的性狀是基盤毛長（0.792）、芒長（0.761）、穎長（0.609）和穎寬（0.555）；第7主成分獨立貢獻率為6.544%，因子載荷最大性狀僅含水量（－0.825）。這7個主成分中，第1主成分由莖粗性狀解釋，第2主成分由產(chǎn)量及其構(gòu)成因子解釋，第3主成分由花序性狀解釋，第4主成分由生育期性狀解釋，第5主成分由旗葉性狀解釋，第6主成分由小穗性狀解釋，第7主成分由含水量解釋。前3主成分解釋力最高，包括產(chǎn)量構(gòu)成因素及花序形態(tài)兩類性狀，與性狀變異系數(shù)所反映的情況基本吻合。

表4 五節(jié)芒表型性狀前7個主成分的特征量和貢獻率Table 4 The component scores coefficient matrix，eigenvalue and contributive percentage of principal of M.floridulus

圖1 53份五節(jié)芒表型性狀的聚類分析Fig.1 Dendrogram of 53 M.floridulus derived by UPGMA from the phenotype data

基于表型性狀的聚類結(jié)果（圖1）表明，53份五節(jié)芒可劃分為3大類群：第Ⅰ聚類組只有1份材料，出苗－開花天數(shù)為117d，屬于遲花類型，無2級以上花序，花序持久小穗部分易脫落；第Ⅱ聚類組包括6份材料，出苗－開花天數(shù)在91～100d，屬于中花類型，2級以上花序數(shù)少，花序能持久但小穗易脫落；第Ⅲ聚類組包括46份材料，其出苗－開花的天數(shù)為85～90d，屬于早花類型，花序形態(tài)為2級以上花序數(shù)多，花序易斷小穗易脫落。

2.2 SSR標(biāo)記分析

2.2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析 33對SSR引物對53份五節(jié)芒進行PCR擴增，部分材料的擴增圖譜如圖2所示，其中26對引物具有多態(tài)性。26對SSR引物擴增結(jié)果見表5。26對SSR引物共擴增出81條DNA帶，平均每對引物擴增3.12條DNA帶，各引物擴增出的條帶數(shù)在1～8。多態(tài)性條帶74條，平均每對引物2.85條，引物的平均多態(tài)性比率（PPB）為91.36%。不同的引物所揭示的供試材料的多態(tài)性信息含量（PIC）范圍為0.086～0.374，平均為0.245。結(jié)果表明SSR分子標(biāo)記在五節(jié)芒中具有良好的多態(tài)性，可以用于五節(jié)芒種質(zhì)間遺傳多樣性分析。各引物所解釋的遺傳多樣性存在一定的差異，53份五節(jié)芒遺傳多樣性指數(shù)在0.061 1～0.491 2，平均為0.258 7，有效等位基因數(shù)在1.064 8～1.965 4，平均為1.417 2，Shannon信息指數(shù)為0.126 6～0.684 3，平均為0.400 4，表明53份五節(jié)芒間遺傳分化豐富（表5）。

表5 SSR引物的多態(tài)性Table 5 The polymorphism of SSR primers

2.2.2 基于SSR標(biāo)記的遺傳相似性和聚類分析 對擴增結(jié)果，計算其相似性系數(shù)和遺傳距離。結(jié)果表明，53份五節(jié)芒遺傳相似性系數(shù)為0.693 2～0.965 9，變幅為0.272 7，其遺傳距離為0.030 1～0.303 9，變幅為0.273 8。其中，采自貴州雷山（7、8）2份材料之間的遺傳相似性系數(shù)最大（0.965 9），其遺傳距離最近（0.030 1），表明這2份材料親緣關(guān)系很近；采自江西南昌（33）與采自安徽金寨（43），相似性系數(shù)最?。?.693 2），其遺傳距離最遠(yuǎn)（0.303 9），表明這2份材料之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分析結(jié)果表明，供試53份五節(jié)芒之間差異明顯，具有相對較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

圖2 HAU－12擴增產(chǎn)物部分電泳圖Fig.2 An amplification profile using SSR primer pair HAU－12

圖3 53份五節(jié)芒SSR標(biāo)記的UPGMA聚類分析Fig.3 Dendrogram of 53 M.floridulus derived by UPGMA from SSR marker

2.2.3 基于SSR標(biāo)記的聚類分析 基于遺傳相似性系數(shù)，利用UPGMA法（非加權(quán)類平均法）構(gòu)建了53份五節(jié)芒材料間的聚類圖（圖3）。在相似性系數(shù)為0.79的水平上，可將供試材料分為8個聚類組。其中，第Ⅰ、Ⅱ聚類組分別為2份南荻和2份芒，為外類群。第Ⅲ聚類組有2份材料，分別采自江西修水（9）和安徽金寨（43）。第Ⅳ聚類組中包括2份材料，分別采自福建寧德（47）和安徽繁昌（39）。第Ⅴ聚類組中包括3份材料，分別采自浙江洞頭（6）、福建福安（49）和浙江金溪（53）。第Ⅵ聚類組中只有1份材料，采自安徽金寨（42）。第Ⅶ聚類組中包括2份材料，分別采自廣西賀州（2）和湖南郴州（20）。其余的43份材料聚為第Ⅷ聚類組。對第Ⅷ聚類組的43份材料進行分析，在相似性系數(shù)為0.84的水平上，43份材料可分為6個亞組。A亞組中共有5份材料，其中3份采自湖南（11、19、32），1份采自廣西（1），1份采自江蘇（19）。B亞組中包括15份材料，其中3份采自貴州（5、7、8），3份采自廣西（24、29、27），2份采自廣東（41、40），2份采自福建（46、51），2份采自湖北（45、48），2份采自江西（31、33），1份采自浙江（4）。C亞組中包括10份材料，其中5份采自湖南（10、25、21、12、14），3份采自江蘇（15、16、17），1份采自福建（52），1份采自安徽（44）。D亞組中只有1份材料，采自湖北黃石（30）。E亞組包括8份材料，其中2份采自廣西（3、28），2份采自福建（38、50），3份采自廣東（34、37、36），1份采自湖北（35）。F亞組包括4份材料，其中3份采自江西（13、22、26），1份采自陜西（23）。聚類結(jié)果顯示，不同地區(qū)的材料具有一定的相似性，聚為一組。相同地理來源的材料遺傳變異較大，供試材料與其最初的地理來源及地理分布并不存在明顯的相關(guān)性。

3 討論

本研究利用表型性狀和SSR標(biāo)記研究了53份五節(jié)芒的遺傳多樣性。結(jié)果表明，這53份五節(jié)芒在表型性狀水平和DNA分子水平上均具有豐富的遺傳多樣性。表型性狀是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，本研究將不同地理來源的五節(jié)芒種植于同一地點（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物種質(zhì)資源圃），使其生長在相同生境下，消除環(huán)境飾變的影響，以了解由基因決定的表型性狀的變異情況。但基于表型性狀數(shù)據(jù)的聚類結(jié)果與SSR標(biāo)記聚類結(jié)果并不完全一致。造成這一結(jié)果的原因可能是：1）表型性狀的檢測水平有限，特別是一些數(shù)量性狀呈連續(xù)變化，很難將不同的材料分類。2）表型性狀包括形態(tài)性狀、生理性狀、生殖性狀等方面，范圍十分廣泛，本研究所選取的25個表型性狀，只能在一定程度上揭示其表型多樣性。3）本研究所選SSR引物并不能揭示整個基因組的變異情況，且有些發(fā)生在DNA水平的變異不一定造成表型性狀的改變，比如內(nèi)含子的變異。53份五節(jié)芒遺傳相似性系數(shù)在0.693 2～0.965 9，遺傳多樣性指數(shù) H＝0.258 7，Shannon信息指數(shù)I＝0.400 4。結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記可用于五節(jié)芒遺傳多樣性分析，53份五節(jié)芒在DNA水平上具有豐富的遺傳多樣性。

SSR分子標(biāo)記因其具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富，目前已廣泛應(yīng)用于多種植物的遺傳多樣性研究中［16－22］。而且SSR標(biāo)記具有一定的通用性，Peakall等［23］研究了31對大豆（Glycine max）SSR 引物在屬內(nèi)和屬間的通用性，結(jié)果表明SSR引物通用性僅限于屬內(nèi)種間和親緣關(guān)系較近的屬間。本研究中所選33對玉米和甘蔗SSR引物中有26對在五節(jié)芒中有多態(tài)性。26對多態(tài)性引物共擴增81條DNA帶，平均每對引物擴增3.12條DNA帶，其中多態(tài)性條帶74條，多態(tài)性比率為91.36%，多態(tài)性信息含量（PIC）范圍為0.086～0.374，平均為0.245。表明玉米和甘蔗SSR引物在五節(jié)芒中有較高的通用性。

刁英等［13］曾對ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記在五節(jié)芒中的分析效率進行了研究，兩種標(biāo)記的遺傳多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)條帶比率分別是0.297 4、0.452 5、95.15%和0.186 6、0.301 8、84.97%。吳安迪等［14］，刁英等［13］均利用ISSR分子標(biāo)記分別對五節(jié)芒進行分析，獲得的五節(jié)芒遺傳相似性系數(shù)分別為0.467 3～0.831 8和0.67～0.95。以上結(jié)果表明，如果供試材料不同或者所用遺傳標(biāo)記不同，所獲得的五節(jié)芒遺傳多樣性的結(jié)論會存在一定的差異。因此，為更準(zhǔn)確地了解五節(jié)芒的遺傳變異情況，應(yīng)用不同的遺傳標(biāo)記對五節(jié)芒進行分析是有必要的。

［1］ Chen S L，Renvoize S A.Miscanthus Andersson.Flora of China（Vol.22）［M］.Beijing：Science Press，and St.Louis：Missouri Botanical Garden Press，2006：581－583.

［2］ 寧祖林，陳慧娟，王珠娜，等.幾種禾本熱值和灰分動態(tài)變化研究［J］.草業(yè)學(xué)報，2010，19（2）：241－247.

［3］ 陳慧娟，張卓文，寧祖林，等.施肥對五節(jié)芒熱值和表型性狀的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2009，26（8）：63－67.

［4］ 陳少風(fēng)，何俊，周樸華，等.芒和五節(jié)芒的核型研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30（1）：123－126.

［5］ 秦建橋，夏北成，趙鵬.五節(jié)芒不同種群對Cd污染脅迫的光合生理響應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)報，2010，30（2）：288－299.

［6］ 遲光宇，劉新會，劉素紅，等.大塢河流域重金屬污染與五節(jié)芒光譜效應(yīng)關(guān)系研究［J］.生態(tài)環(huán)境，2005，14（4）：549－554.

［7］ 王江，張崇邦，常杰等.五節(jié)芒對重金屬污染土壤微生物生物量和呼吸的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19（8）：1835－1840.

［8］ 張崇邦，王江，王美麗.尾礦砂堆積地五節(jié)芒自然定居對土壤微生物生物量、呼吸速率及酶活性的影響［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2009，15（2）：386－394.

［9］ 張崇邦，王江，柯世省，等.五節(jié)芒定居對尾礦砂重金屬形態(tài)、微生物群落功能及多樣性的影響［J］.植物生態(tài)學(xué)報，2009，33（4）：629－637.

［10］ 蕭運峰，高潔.五節(jié)芒的分化類型及生產(chǎn)性狀的比較研究［J］.四川草原，1998，（1）：21－23.

［11］ 丁明輝.五節(jié)芒栽培茶薪菇試驗［J］.食用菌，2009，（1）：24.

［12］ 劉葉高.五節(jié)芒栽培杏鮑菇等三種珍稀食用菌試驗研究［J］.現(xiàn)代園藝，2006，（7）：4－5.

［13］ 刁英，胡小虎，鄭興飛，等.利用SRAP和ISSR標(biāo)記分析五節(jié)芒（Miscanthus floridulus）的遺傳多樣性［J］.武漢大學(xué)學(xué)報，2010，56（5）：578－583.

［14］ 吳安迪，黃小龍，黃東益.利用ISSR標(biāo)記分析海南島五節(jié)芒的遺傳多樣性［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（24）：93－97.

［15］ 李志勇，王宗禮，師文貴，等.牧草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：9－38.

［16］ 徐雁鴻，關(guān)建平，宗緒曉.豇豆種植資源SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析［J］.作物學(xué)報，2007，33（7）：1206－1209.

［17］ Dikshit H K，Jiang T，Singh N K，et al.Genetic differantiation of Vigna species by RAPD，URP and SSR makers［J］.Biologia Plantarum，2007，51（3）：451－457.

［18］ Ren F G，Lu B R，Li S Q，et al.A comparative study of genetic relationships among the AA－genome Oryzaspecies using RAPD and SSR makers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，108：113－120.

［19］ Huang K H，Chiang T Y，Chiu C T，et al.Isolation and characterization of microsatellite loci from a potential biofuel plant Miscanthus sinensis （Poaceae）［J］.Conservation Genetics，2009，10：1377－1380.

［20］ Ma K H，Kim N S，Lee G A，et al.Development of SSR markers for studies of diversity in the genus Fagopyrum［J］.Theoretical and Applied Genetics，2009，119：1247－1254.

［21］ 鄢家俊，白史且，張新全，等.青藏高原東南緣老芒麥自然居群遺傳多樣性的SRAP和SSR分析［J］.草業(yè)學(xué)報，2010，19（4）：122－134.

［22］ 陳永霞，張新全，謝文剛，等.利用EST－SSR標(biāo)記分析西南扁穗牛鞭草種質(zhì)的遺傳多樣性［J］.草業(yè)學(xué)報，2011，20（6）：245－253.

［23］ Peakall R，Gilmore S，Keys W，et al.Cross－species amplication of soybean（Glycine max）simple sequence repeats（SSRs）within the genus and otherlegume genera－implications for the transferability of SSRs inplants［J］.Molecular Biology and Evolution，1998，15（10）：1275－1287.