盧玉飛，蔣建雄，易自力

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙410128）

芒屬（Miscanthus）（禾本科Poaceae）是一類C4高大禾草。因其具有適宜作為新一代非糧食能源植物開發(fā)利用的潛力而備受關(guān)注［1－4］。按 Chen和 Renvoize［5］的分類體系，中國的芒屬植物包含芒（Miscanthus sinensis）、五節(jié)芒（M.floridulus）、荻（M.sacchariflorus）、南荻（M.lutarioriparius）、尼泊爾芒（M.nepalensis）、雙藥芒（M.nudipes）和紅山茅（M.paniculatus）等7個種。盡管我國的芒屬植物資源豐富，但對其遺傳多樣性的了解并不多。

微衛(wèi)星，或言之簡單序列重復（simple sequence repeats，SSRs）以一種由短的堿基基序構(gòu)成的長陣列形式廣泛分布于真核生物基因組內(nèi)，長1～6bp（base pairs，bp）［6，7］。根據(jù)開發(fā)SSR標記所依據(jù)的序列的不同性質(zhì)，SSR標記可分為基因組SSR（genomic SSR，gSSR）和表達序列標簽SSR（expressed sequence tags SSR，ESTSSR）［8］。EST是通過對cDNA文庫中隨機挑取的克隆進行大規(guī)模測序所獲得的cDNA的5′或3′端序列，長度一般為150～500bp［8］。EST－SSR是指EST序列中包含的SSR，因來源于編碼DNA而與基因表達有關(guān)［9］。作為功能基因的一部分，EST－SSR的側(cè)翼區(qū)往往受到功能性約束而使得其歧化速率慢，所以該側(cè)翼區(qū)序列在物種間很保守。已有研究表明，這2種SSR標記在物種及其近緣種間，甚至在該物種與某些遠緣種之間都具有比較高的通用性［7，10－12］。

由于通過文庫篩選來開發(fā)SSR引物的成本高昂，并且因為通過公共數(shù)據(jù)庫搜索來獲得適用序列來開發(fā)芒屬SSR引物的機會也小，因此根據(jù)SSR側(cè)翼區(qū)序列保守性的特點，從現(xiàn)有近緣種的SSR引物中篩選獲取可用于芒屬植物擴增的SSR引物是一個現(xiàn)實選擇［10］。Hernández等［10］考察了76對玉米（Zea mays）SSR引物在2份芒屬雜交種中的擴增情況，并接著使用了11份材料開展多樣性研究，結(jié)果表明玉米的微衛(wèi)星引物在芒屬中的通用性很高。鐘智林等［13］比較了30對玉米SSR引物在15份芒屬材料中的擴增情況，結(jié)果表明玉米SSR引物適用于芒屬植物遺傳多樣性分析。Hung等［14］的研究則表明來自芒的9個微衛(wèi)星位點在五節(jié)芒中能實現(xiàn)種間擴增。馬洪崢等［15］利用尼泊爾芒和雙藥芒的6份材料，篩選得到14對能產(chǎn)生穩(wěn)定擴增的SSR引物，并進而評價認為所獲得的這14個SSR位點在雙藥芒組遺傳學研究中的適用性強。Zhou等［16］從芒中開發(fā)了14個SSR位點，其中12個在五節(jié)芒、荻、南荻中能實現(xiàn)種間擴增。Ho等［17］的研究則表明源自M.sinensis fo.glaber的轉(zhuǎn)錄區(qū)的12個多態(tài)性微衛(wèi)星位點能在芒的所有變種及五節(jié)芒中實現(xiàn)類群間擴增。

本研究以我國芒屬植物的全部7個種為材料，對382對玉米SSR引物和100對甘蔗（Saccharum officinarum）EST－SSR引物的通用性進行研究，尋找適用于芒屬相關(guān)遺傳學研究的SSR引物，并在此基礎(chǔ)上初步探討中國芒屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為開展相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗材料采自湖南農(nóng)業(yè)大學芒屬種質(zhì)資源圃。80份芒屬材料以及作為外類群的4份甘蔗屬（Saccharum）材料的詳細信息見表1。類群名稱按Chen和Renvoize［5］的分類體系。

1.2 引物

382對玉米SSR引物為Sigma－Aldrich公司產(chǎn)品（St.Louis，MO USA）；100對甘蔗EST－SSR引物序列由美國Illinois大學Erik Sacks博士提供，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取 每份材料從一個單株里選取生長狀況良好的新鮮健康嫩葉，總DNA提取方法參照CTAB法［18］并稍加改良。所有DNA母液于－70℃保存。

1.3.2 引物篩選 引物篩選分2個環(huán)節(jié)進行：前期篩選以獲得初步認為有效的引物、應用初步有效的引物對上述84份材料進行擴增。在前期引物篩選（即初篩）環(huán)節(jié)，每次擴增電泳同時檢測若干對引物，從芒屬的每個類群及每個外類群中各抽取1～3份材料來使用。擴增反應體系為15μL，含2μL（約50ng）模板DNA、0.02 mmol／L 引物、2.5mmol／L Mg2＋、0.2mmol／L dNTPs、0.5UTaq DNA polymerase（廣州東盛生物技術(shù)有限公司）、1.5μL 10×PCR buffer。擴增反應在PCR儀 （Biometra，Germany）上完成。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30s，56～60℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)35；72℃保持7min。根據(jù)擴增結(jié)果和已有經(jīng)驗，完全無帶或僅有細帶或弱帶的引物都舍棄，認為該引物無效。其中，2008年11－12月完成玉米SSR引物的前期篩選，這當中使用的部分供試材料不在上述84份材料之列，篩選時使用的退火溫度通常為58℃，少量引物使用60℃；甘蔗EST－SSR引物的前期篩選是于2010年1－2月使用上述84份材料中的部分材料來完成的，篩選時所有引物使用的退火溫度均為56℃。用于每次擴增的材料都同時包含了中國芒屬植物的至少大部分種類。

然后，進一步應用初步認為有效的引物對上述84份材料進行擴增。擴增反應體系和程序同前期篩選所應用的，但已根據(jù)初篩的擴增情況來適當調(diào)整了退火溫度。擴增產(chǎn)物通過12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，AgNO3染色檢測。選擇擴增條帶清晰且有多態(tài)性的引物來使用，舍棄擴增效果不佳或條帶過于復雜而無法準確判讀的引物。每一對確定有效的引物在優(yōu)化好退火溫度后，都將保持相同條件再重復一遍擴增和電泳以檢驗擴增條帶的穩(wěn)定性。根據(jù)在同一電泳遷移位置上穩(wěn)定、清晰的擴增條帶的有／無，記為1／0矩陣。為確保讀帶的誤差盡可能小，帶型過于復雜而無法準確判讀的擴增條帶都舍棄不讀。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 計算不同引物的多態(tài)性條帶百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）。采用 NTSYSpc－2.10e［19］軟件計算遺傳相似度（genetic similarity，GS），并按非加權(quán)類平均法（unweighted pair group method with arithmetic averaging，UPGMA）進行聚類。

表1 84份供試材料Table 1 84accessions of plant materials

續(xù)表1 Continued

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

從382對玉米SSR引物和100對甘蔗EST－SSR引物中，初步篩選獲得在供試類群中至少都能產(chǎn)生較清晰主帶的引物分別有92對（24.08%）和29對（29.00%），初步認為這些引物是有效引物。利用這些引物對上述84份材料統(tǒng)一進行PCR擴增，條帶較清晰且有多態(tài)性的分別為54對（14.14%）、19對（19.00%）。其中一些引物因擴增條帶不清晰或者因為其中某些條帶過于復雜以致無法在所有供試材料中準確判讀等因素而被放棄使用，剩余39對（10.21%）玉米SSR引物和13對（13.00%）甘蔗EST－SSR引物，條帶清晰穩(wěn)定且能準確無誤判讀，而用于進一步的遺傳分析。

用篩選獲得的這52對引物對上述84份材料進行PCR擴增，結(jié)果共得到250條帶，平均每對引物獲得4.81條，每對引物擴增條帶數(shù)為2～9條。部分引物的擴增圖譜如圖1和圖2所示。其中在芒屬中總共得到220條帶，絕大多數(shù)條帶大小在100～200bp，平均每對引物獲得4.23條；這當中多態(tài)性條帶206條（93.64%），平均每對引物3.96條。其中，在玉米SSR引物和甘蔗EST－SSR引物中各有1對引物，即分別為p－umc1170和BQ537250a，它們在芒屬材料中表現(xiàn)為單態(tài)性。

圖1 玉米SSR引物p－mmc0132的擴增圖譜Fig.1 Amplification products from the locus of p－mmc0132from maize SSR

圖2 甘蔗EST－SSR引物BQ478949a的擴增圖譜Fig.2 Amplification products from the locus of BQ478949afrom sugarcane EST－SSR

2.2 特異性條帶

這52對引物在對上述80份芒屬供試材料進行PCR擴增時，擴增條帶中出現(xiàn)了一些可能比較有利用價值的特異性條帶（表2）。在中國芒屬植物中，它們僅為某一或某些類群所擁有，這些類群在本研究中稱為專屬類群。

2.3 玉米SSR引物與甘蔗EST－SSR引物擴增效果對比

這2種引物的擴增效率非常相近，但甘蔗EST－SSR引物的多態(tài)性稍強于玉米SSR引物的（表3）。倘若在數(shù)據(jù)分析中去掉在內(nèi)類群材料芒屬中擴增結(jié)果無多態(tài)性的p－umc1170和BQ537250a這2對引物，甘蔗ESTSSR引物的擴增效率和多態(tài)性均略優(yōu)于玉米SSR引物的。

2.4 聚類分析

采用NTSYSpc－2.10e軟件計算得到的遺傳相似系數(shù)（GS）為0.588～0.988。聚類結(jié)果（圖3）表明，在GS＝0.68水平上，中國芒屬植物分為兩大類群：第一類由尼泊爾芒、雙藥芒、紅山茅構(gòu)成，第二類由芒、五節(jié)芒同荻、南荻組成；在GS＝0.82上，第二類又分成了由芒與五節(jié)芒構(gòu)成的一支和由荻與南荻構(gòu)成的另一支；在GS＝0.88上，芒與五節(jié)芒分開，各自成為一個分支。這些分支以及由荻和南荻構(gòu)成的分支又各自形成了很多次級分支。

表2 39對玉米SSR引物和13對甘蔗EST－SSR引物在芒屬中的擴增效果Table 2 Amplification effects of 39maize SSR primer pairs and 13sugarcane EST－SSR primer pairs in Miscanthus

續(xù)表2 Continued

表3 玉米SSR引物與甘蔗EST－SSR引物在芒屬中的擴增效果對比Table 3 Comparison on amplification effects between maize SSR primer pairs and sugarcane EST－SSR primer pairs in Miscanthus

圖3 80份芒屬材料的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA clustering figure for the 80accessions in Miscanthus

3 討論

3.1 SSR標記的通用性

Hernández等［10］的研究表明，76對玉米的SSR引物里有57對（75%）引物在芒屬DNA中實現(xiàn)可重復擴增。使用其中的17對引物擴增芒屬的11份材料，遺傳相似度為0.35～0.92，結(jié)果表明玉米的微衛(wèi)星引物對芒屬的通用性很高。馬洪崢等［15］的研究則表明，核心芒屬的SSR位點在雙藥芒組中的同源擴增比率為52.17%。

本研究中，這382對玉米SSR引物以及100對甘蔗EST－SSR引物往往都能產(chǎn)生擴增條帶，但一些引物因擴增條帶很細弱或者在全部84份供試材料中只產(chǎn)生一條帶而被剔除。而且為了確保條帶統(tǒng)計時的準確性，條帶過于復雜而無法準確判讀的那些引物也被舍棄。經(jīng)過這2次篩選，最后可用的引物不多，這導致了本研究中這2種引物的通用性較低。已有研究表明EST－SSR引物較普通SSR引物的通用性效果更佳［20］。而從本研究結(jié)果來看，總體上甘蔗EST－SSR引物較玉米SSR引物的通用性稍好一點，對揭示中國芒屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性更為有效。這反映了基于源自轉(zhuǎn)錄區(qū)的EST開發(fā)而來的EST－SSR標記比傳統(tǒng)SSR標記更保守，通用性更強。

3.2 特異性條帶與芒屬資源評價

當前中國芒屬植物中的4個主要類群：芒、五節(jié)芒、荻和南荻是最為引人關(guān)注的，因為它們生物量大、分布廣，應用潛力大，尤其是南荻植株高大且冬季枯黃，極具應用潛力。本研究揭示的這些特異性條帶將有可能為中國芒屬種質(zhì)資源的評價、分子輔助育種提供可靠依據(jù)。比如，本研究表明在上述80份芒屬的供試材料中，引物pmmc0132擴增條帶中的170bp這條帶是僅荻與南荻共有的條帶，引物p－umc1542擴增條帶中的130bp這條帶是僅芒與五節(jié)芒共有的條帶，引物p－bnlg125擴增條帶中的280bp、引物p－umc2036擴增條帶中的150bp、引物CA069343b擴增條帶中的370bp等這些條帶是僅芒、五節(jié)芒、荻和南荻共有的條帶。這些條帶將為這些類群的雜交種鑒定及種質(zhì)資源評價提供幫助。而對于那些中國芒屬植物7個種類都共有的帶，可以利用它們來幫助鑒定一些疑似材料是否屬于芒屬。

3.3 芒屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性

芒屬種質(zhì)資源及其遺傳多樣性是芒屬能源作物遺傳改良和新品種育種的基礎(chǔ)。對中國芒屬植物遺傳多樣性的評價有利于了解其遺傳背景、促進有利基因發(fā)掘、鑒定最優(yōu)親本組合。本研究結(jié)果初步表明中國芒屬植物種質(zhì)資源蘊含比較豐富的遺傳多樣性。同時表明，芒、五節(jié)芒、荻和南荻的相似性較高，相似度為0.780～0.988，說明它們之間的遺傳距離較近，遺傳基礎(chǔ)可能相對較為狹窄。而尼泊爾芒、雙藥芒、紅山茅同這4個大家平常都比較容易關(guān)注到的種類的遺傳距離卻較遠。它們主要分布于西南高山地區(qū)，具有一定程度的耐寒和抗旱特性。建議在選育適宜作為能源作物開發(fā)利用的芒屬新品種時，親本選配可以適當考慮這三者，以拓寬遺傳基礎(chǔ)，發(fā)掘有利基因，促進中國芒屬植物的遺傳改良和新品種培育。

致謝：感謝美國Illinois大學的Erik博士提供了甘蔗EST－SSR引物序列。

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