燕麗萍，劉翠蘭，李麗，李雙云，楊慶山，孫超，梁慧敏，張穎，張兆云，夏陽＊

（1.山東省林業(yè)科學研究院，山東 濟南250014；2.山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟南250014；3.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院，江蘇 句容212400；4.山東省海陽市林業(yè)局，山東 海陽265100）

苜蓿（Medicago sativa）被譽為“牧草之王”，是優(yōu)良的經(jīng)濟生態(tài)植物，但現(xiàn)有的苜蓿品種，無論國內培育還是國外引進，抗旱、耐鹽能力仍然有限［1，2］。傳統(tǒng)的苜蓿抗逆育種由于受種內抗逆基因資源的限制［3］，育種難度不斷增大。利用轉基因技術將抗逆基因導入苜?；蚪M中，是培育耐鹽抗旱苜蓿新品種的有效方法。本課題組培育的耐鹽抗旱轉BADH基因苜蓿新品種，推動飼草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展、提升養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展水平、帶動區(qū)域經(jīng)濟快速發(fā)展、促進農(nóng)民增收具有重要的經(jīng)濟作用；特別是提高黃河三角洲和內陸鹽堿干旱地區(qū)植被恢復，緩解生態(tài)惡化等方面具有重要的生態(tài)和社會意義。

然而，隨著轉基因技術的飛速發(fā)展以及轉基因植物的大面積種植，在關注轉基因植物所帶來的巨大社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益的同時，轉基因植物的安全性問題也引起了世界范圍內的廣泛關注。目前，轉基因植物風險評價主要集中在轉基因植物與近緣物種的基因流［4］、目標害蟲的抗性［5］以及對非目標動植物的多樣性和生態(tài)系統(tǒng)［6］的影響，在其是否會導致嚴重的生態(tài)環(huán)境問題方面存在分歧。近年來，轉基因植物對土壤生態(tài)環(huán)境、土壤微生物群落結構和多樣性的影響是轉基因植物生態(tài)評價中一個很重要的內容，已成為一個研究熱點。

土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中物質轉化與能量交換的重要場所，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中居核心地位，土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分［7，8］。因此開展轉基因植物對土壤微生物影響方面的研究對科學評價轉基因植物安全性潛在的生態(tài)風險具有重要地位和生態(tài)學意義。為探討轉基因植株對土壤微生物種類和數(shù)量變化的影響程度，本研究以實驗室成功獲得轉BADH基因苜蓿［9－12］，并于2008年獲得國家林業(yè)局“轉BADH基因苜?！杯h(huán)境釋放和生產(chǎn)試驗行政許可證進入田間試驗階段的轉基因苜蓿和非轉基因親本苜蓿對照（中苜1號）為材料，連續(xù)2年對其根圈土壤微生物種類和數(shù)量進行監(jiān)測，評估其潛在生物安全風險，以期為建立轉基因植物對土壤生態(tài)風險評價體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為轉BADH基因紫花苜蓿，對照為常規(guī)紫花苜?！爸熊?號”。

1.2 試驗地

大田試驗在山東省林業(yè)科學研究院東營分院實驗基地進行。實驗地的土壤類型包括潮土和鹽化潮土，其土壤鹽分以NaCl為主，土壤為潮土和鹽土，其含鹽量介于3‰～5‰。

1.3 試驗設計

轉基因苜蓿和對照中苜1號，采用完全隨機區(qū)組設計，每品種重復3次，小區(qū)面積為32m2（8m×4m），試驗地四周設1.5m保護行。2006年8月24日播種，條播，行距50cm，播深1～2cm，播種量為7.5kg／hm2，管理比較粗放，種植當年灌水1次。

1.4 土壤取樣和微生物培養(yǎng)

分別在2008和2009年的7，8，9月以東營轉基因苜蓿和對照試驗地作為土壤采樣地。利用3點混合采樣法采集0～20cm的土壤，保鮮帶回實驗室。每份土壤樣本各稱10g放于90mL無菌水中，振蕩30min后，依次稀釋為不同濃度的稀釋液。分別取100μL，涂布不同培養(yǎng)基平板，細菌采用牛肉膏蛋白胨麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，真菌采用馬丁氏孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，放線菌采用淀粉銨鹽瓊脂培養(yǎng)基，每一處理重復3次，保溫培養(yǎng)。細菌37℃、培養(yǎng)2～3d，真菌25℃培養(yǎng)5～7d，放線菌28℃培養(yǎng)7～10d，記錄菌落數(shù)在30～300內的平板菌落數(shù)。根據(jù)下式計算：土壤微生物數(shù)量（個／g）＝菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)／土壤重量（g）［13］。

1.5 土壤總DNA的提取

1.5.1 DNA的提取 土壤總DNA的提取采用Omega公司的Soil DNA Kit試劑盒，分別稱取混合好的土樣0.5g，按照操作說明書進行提取，制備好的DNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 微生物菌株的DNA提取 細菌、真菌和放線菌基因組DNA的提取參考魏冰等［14］的方法提取。

1.6 土壤總DNA的PCR擴增反應

以土壤總DNA和菌株DNA為模板，質粒DNA為陽性對照，雙蒸水（ddH2O）為陰性對照。根據(jù)BADH序列設計特異引物（F：5’－AGA ATG GCG TTC CCA ATT CCT GCT C－3’；R：5’－TTC AAG GAG ACT TGT ACC ATC CCC A－3’，由上海生工生物工程公司合成）進行PCR擴增，擴增片段的大小為1.5kb。PCR反應體系總體積為25μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL （天根生化科技有限公司），F(xiàn) （10μmol／L）1μL，R （10 μmol／L）1μL，ddH2O 10.5μL。擴增反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃1.5 min，循環(huán)30次，72℃延伸10min。電泳Marker為TAKARA公司生產(chǎn)的DL15000，擴增后用1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在紫外燈下觀察拍照。

1.7 統(tǒng)計分析

本實驗測定的數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值，所有數(shù)據(jù)用SPPS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，平均數(shù)用LSD法進行比較。

2 結果與分析

2.1 轉基因苜蓿地土壤微生物的變化

分別對轉基因苜蓿地和非轉基因苜蓿地土壤微生物進行分類統(tǒng)計，計算平均數(shù)（表1）。通過連續(xù)2年6個月的數(shù)據(jù)顯示，轉基因苜蓿地和未轉基因苜蓿地土壤中微生物細菌、放線菌和真菌的數(shù)量變化趨勢一致，表現(xiàn)為8月微生物數(shù)量達到高峰，9月份下降，總體上7，8，9月份細菌、真菌和放線菌數(shù)量呈先升后降的趨勢。2年間土壤微生物細菌均占優(yōu)勢，其次為放線菌，真菌數(shù)量最少，這種現(xiàn)象與自然條件下土壤微生物數(shù)量的分布比例一致。盡管不同年份這2個苜蓿品種種植地細菌、放線菌和真菌的數(shù)量有變化，2009年細菌和真菌數(shù)量比上一年下降，放線菌數(shù)量比上一年增加，但是微生物數(shù)量變化趨勢一致，沒有發(fā)生某一類微生物數(shù)量驟增或驟減的現(xiàn)象。表明轉基因植株沒有破壞主要微生物種類之間的平衡。

2.2 苜蓿地間土壤微生物的比較

分別對2年生轉基因苜蓿地和3年生轉基因苜蓿地在6個月內的3種土壤微生物數(shù)量進行單因素方差分析與多重比較（表2）。結果表明，轉基因植株地與非轉基因植株地之間的細菌數(shù)量、放線菌和真菌數(shù)量無差異顯著。說明該試驗地轉BADH 基因苜蓿的外源基因在調查的2年內尚未對種植地內的土壤微生物種類和數(shù)量造成顯著影響。

表1 不同年份不同月份土壤微生物數(shù)量Table 1 Populations of microorganism in the soil of the different months in the different years 個 No.／g

2.3 2年間土壤微生物數(shù)量對比

對2008和2009年不同年份同一月份的土壤3種微生物數(shù)量進行單因素方差分析和多重比較（表3）。結果表明，土壤細菌數(shù)量所有月份年份間的差異均不顯著（P＞0.05）。土壤真菌數(shù)量在7月份的差異達到顯著水平（P＜0.05），而其余月份均無顯著差異。土壤放線菌數(shù)量在所有月份年份間差異均不顯著（P＞0.05）。由此可見，不同種植年限的轉基因苜蓿土壤細菌數(shù)量、放線菌數(shù)量和真菌數(shù)量差異未達顯著水平，個別月份年份間雖有差異，推測可能為自然條件的差異所致，說明轉基因苜蓿種植年限的增加并未對土壤微生物生態(tài)安全造成影響。

2.4 外源基因水平轉移到根系土壤微生物可能性分析

以試驗地內土壤微生物基因組DNA混合樣品和菌株DNA為模板、利用目的基因BADH基因特異性引物進行PCR反應，所得結果見圖1。陽性質粒對照進行的PCR反應有目的條帶的產(chǎn)生，而所有土壤微生物DNA樣品、各類培養(yǎng)菌株DNA和無模板水對照樣品均未檢測到目的基因PCR擴增產(chǎn)物（圖1），表明本試驗地內轉基因苜蓿的目的基因BADH尚未水平轉移到土壤微生物中。

表2 株系間土壤微生物單因素方差分析Table 2 ANOVA results of microorganism in the soil of different lines

表3 不同年份相同月份土壤微生物單因素方差分析Table 3 ANOVA results of microorganism in the soil of the same months in the different years

3 討論

轉基因植物自商業(yè)化種植以來，其對環(huán)境的影響備受關注和爭議，轉基因植物對土壤生物可能造成的影響一直是人們進行轉基因植物安全性評價的焦點，轉基因植物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響列為風險評價的重要組成部分。轉基因植物外源基因表達產(chǎn)物經(jīng)根系分泌后進入土壤生態(tài)系統(tǒng)從而影響土壤微生物群落，使土壤的特異生物功能類群以及土壤生物多樣性都有可能因此改變。一些研究表明，種植轉基因植物對土壤微生物產(chǎn)生了明顯的影響。沈法富等［15］發(fā)現(xiàn)在棉花（Gossypium hirsutum）發(fā)育的花鈴期和吐絮期，Bt棉根際細菌生理群的總數(shù)量比常規(guī)棉增加，但是根際細菌生理群的Simpson指數(shù)、Shannon－Wiener指數(shù)和細菌生理群分布的均勻度下降。劉佳等［16］研究了抗草甘膦轉基因大豆（Glycine max）不同程度上降低了根際土壤微生物的數(shù)量和生化強度，并對根際土壤真菌生長有一定的促進作用。Dunfield和Germida［17］研究了在加拿大的4個不同田塊連續(xù)2年種植4種轉抗除草劑基因的油菜（Brassica campestris）和4種常規(guī)油菜品種對根際微生物多樣性的影響。轉基因油菜的根際微生物群落在一些脂肪酸上顯著偏高，表明其微生物群落組成發(fā)生了變化。

圖1 BADH基因在土壤微生物基因組DNA中的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of BADHgene in genomic DNA of soil microorganism

但多數(shù)研究結果表明，轉基因植物對土壤生物影響較小，周琳等［18］研究結果表明，幾丁質酶和核糖體失活蛋白雙價基因的導入并沒有對大豆根際可培養(yǎng)細菌（含芽胞桿菌和產(chǎn)熒光假單胞）、真菌和放線菌的數(shù)量以及細菌和真菌的群落結構產(chǎn)生顯著影響。Donegan等［19，20］在研究轉基因Bt棉花和轉基因馬鈴薯（Solanum tuberosum）的根系分泌物對土壤中細菌的影響時，發(fā)現(xiàn)根系細菌數(shù)量短期內在轉基因植物與對照組之間并無明顯差異。Schmalenberger和Tebbe［21］等在研究轉基因玉米（Zea mays）、轉基因歐洲黑楊、轉基因銀腺雜種楊和轉基因毛白楊雜種［14，21－23］等轉基因植物對根部土壤微生物也沒有顯著影響。本研究通過對轉基因草地與非轉基因草地土壤微生物數(shù)量連續(xù)2年的調查分析，結果證明轉基因苜蓿尚未對土壤微生物數(shù)量造成影響。對不同年份同一月份的土壤微生物數(shù)量進行均值比較與單因素方差分析，結果發(fā)現(xiàn)3種微生物數(shù)量無顯著差異，初步說明轉基因苜蓿種植年限的增加并未對土壤微生物系統(tǒng)造成影響。

另外，由于不可培養(yǎng)的微生物占據(jù)微生物總數(shù)的90%以上［24］，傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法的局限性，不能對土壤中的微生物進行全面、系統(tǒng)的分析。本試驗通過提取土壤中群體微生物總DNA和提取單個菌株DNA的方法，從分子生態(tài)學角度檢測了外源基因在土壤微生物中是否發(fā)生了基因水平轉移。在菌株DNA和土壤總DNA中都沒有發(fā)現(xiàn)外源基因，充分證明了導入的外源基因沒有引起土壤微生物群落數(shù)量和群落組成結構的變化，尚未水平轉移到土壤微生物中，該遺傳操作是安全的。

綜上所述，本試驗結合傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法和不依賴于培養(yǎng)的PCR技術，在多個月份對土壤細菌、真菌、放線菌的數(shù)量進行了連續(xù)2年的監(jiān)測，獲得大量相關數(shù)據(jù)，進行了全面系統(tǒng)的研究。結果表明，BADH外源基因的導入，并沒有引起土壤微生物的數(shù)量和群落結構的顯著變化，說明外源基因的轉入對于土壤微生物的環(huán)境是安全的。本研究初步為該轉基因抗鹽堿苜蓿的商業(yè)化種植提供了科學依據(jù)和理論基礎，也為其他轉基因植物土壤微生物安全性研究提供了可靠的參考。然而，轉基因植物安全性監(jiān)測是一個重要的、長期而復雜的過程，因此對轉BADH基因苜蓿生態(tài)安全性的了解需要長期的跟蹤、深入、系統(tǒng)的調查，未來的長期影響尚待進一步研究。

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