王蔚芳，柴書軍，劉慶堂，雷霽霖，丁福紅，洪 磊，劉新富，蘇 柯

(1．中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室，青島 266071;2．河南省農(nóng)業(yè)科學院，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002;3．青島通用水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，青島 266404)

1 前言

魚類是具有細胞免疫和體液免疫系統(tǒng)的水生脊椎動物，抗體(免疫球蛋白)是機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的最主要介質(zhì)。當魚體受到外來物質(zhì)刺激后(如病害、疫苗等)，其體內(nèi)會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體以保護機體免受病害的侵襲［1］。據(jù)此，通過對特異性抗體的檢測，便可實現(xiàn)對疾病的早期診斷和預(yù)警，并能對疫苗免疫效果進行評價。然而，現(xiàn)有的抗體檢測方法如酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫熒光、核酸雜交技術(shù)等，均存在檢測費時費力、成本高且需要專用儀器或?qū)I(yè)人員操作等問題，不利于抗體的現(xiàn)場快速檢測，限制了魚病的早期快速診斷。因此，在當前水產(chǎn)養(yǎng)殖高度發(fā)達時期，研究建立一種適用于魚類抗體的快速、靈敏、經(jīng)濟適用、操作簡便的現(xiàn)場快速檢測方法就顯得特別迫切。

通過膠體金免疫層析原理研制成功的檢測試紙可以做到不需要專業(yè)技能和儀器，操作簡單，易于推廣應(yīng)用，是實現(xiàn)養(yǎng)殖魚類抗體現(xiàn)場快速檢測和病害早期快速診斷的一種有效方法。自20世紀80年代末以來，這一方法已應(yīng)用于多種分析物，包括抗原、半抗原、抗體和核酸的定性和半定量快速檢測［2］，已成為當代最快捷、敏感的免疫學檢測技術(shù)之一，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學領(lǐng)域［3］，然而在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，該研究與檢測方法的建立尚屬首次。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是從歐洲引進我國的海水養(yǎng)殖名貴魚種，現(xiàn)已成為我國北方工廠化養(yǎng)殖的主養(yǎng)品種之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大和養(yǎng)殖密度的不斷增加，疾病問題日顯突出［4］。為了推進大菱鲆工廠化養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展，研究病害的早期快速診斷和及時有效的防治技術(shù)顯得極為重要。分析膠體金免疫層析檢測試紙在陸生動物、畜牧業(yè)上的成功應(yīng)用，引發(fā)人們考慮將其引入海水養(yǎng)殖魚類中應(yīng)用的可行性。文章采用膠體金免疫層析原理，結(jié)合水生動物的免疫學與生態(tài)環(huán)境特點進行結(jié)構(gòu)與方法上的整體改造，以成分單一的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為模擬病原，制作大菱鲆抗體檢測試紙，用以檢測其BSA抗體，建立起首個大菱鲆抗體快速檢測技術(shù)。一方面可以驗證膠體金免疫層析檢測試紙在海水魚類中應(yīng)用的可行性，另一方面有利于建立大菱鲆抗體檢測試紙的通用模型并使之迅速達到實用化。在此基礎(chǔ)上，如更換試紙上的BSA印記，便可以制備成其他疾病的抗體檢測試紙，進而可供研發(fā)水產(chǎn)動物系列病害和藥物殘留等多種用途的新型快速檢測工具。這一方法的成功建立在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中無疑具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。

2 材料與方法

2．1 實驗動物

實驗用健康大菱鲆系購自青島通用水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，平均體重為700～800 g;用于制備多克隆抗體的新西蘭白兔系購自河南省農(nóng)業(yè)科學院，體重約2 kg，飼養(yǎng)于實驗室動物房內(nèi)備用。

2．2 大菱鲆血清免疫球蛋白的提取與純化

從健康大菱鲆尾靜脈采血，室溫下靜置1 h，4 ℃過夜，次日離心(5000 r/min，30 min，4 ℃)分離血清，分裝并保存于-70℃冰箱待用。

大菱鲆血清免疫球蛋白(immunoglobulin M，IgM)分離純化的操作方法如下:大菱鲆血清以等體積0．01 mol/L(pH=7．4)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋后，在 0．01 mol/L(pH=5．4)磷酸緩沖液(phosphate buffer，PB)中4 ℃透析，離心(3000 r/min，30 min，4℃)收集沉淀后，將沉淀溶解于0．1 mol/L(pH=5．4)PB中后繼續(xù)按上述方法透析，再次離心收集沉淀后將其溶解于0．1 mol/L(pH=8．6)PB中，通過 Sephadex-200凝膠柱(80 cm × 1．5 cm)的進一步純化，以0．1 mol/L(pH=8．6)PB為洗脫緩沖液，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢驗，收集純度高的樣品，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．3 多克隆抗體的制備及檢測

將純化的大菱鲆血清IgM與等體積的弗氏完全佐劑(Pierce，USA)混勻乳化后，對新西蘭白兔背部皮下多點注射，每兔注射1 mL(含0．1 mg IgM)(首免);21 d后，將 IgM與弗氏不完全佐劑(Pierce，USA)等比混勻乳化后，進行加強免疫，每兔注射1 mL(含0．2 mg IgM)(二免);21 d后，以相同劑量和方法再次加強免疫(三免);21 d后，以2 mL(含0．3 mg IgM)的量再次加強免疫(四免)。四免21 d后通過心臟取血并分離血清，保存于-70℃冰箱備用。免疫期間定期從兔耳緣靜脈取血，分離抗血清，用間接ELISA法檢測兔血清抗體效價。

2．4 間接ELISA法的建立及抗體的檢測

兔抗IgM血清效價檢測:以0．05 mol/L(pH=9．6)碳酸鹽溶液稀釋 IgM 至 2 μg/mL，取 50 μL 稀釋液加入96孔酶標板孔中，置4℃冰箱中過夜包被，次日以0．01 mol/L(pH=7．4)磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline with 0．05%Tween-20，PBST)洗滌3次，每次3 min;用5%豬血清于37℃封閉1 h，封閉結(jié)束后以PBST同法洗滌;將兔抗IgM血清作為第一抗體，以1︰100開始倍比稀釋，每孔加入50 μL，陰性對照為PBS，于37℃反應(yīng)15 min后以PBST同法洗滌;每孔加入50 μL羊抗兔IgG-HRP(1︰1000稀釋)，于37℃反應(yīng)30 min后洗滌;每孔加入新配制的50 μL顯色液四甲基聯(lián)苯胺 (3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB)顯色5 min后，加入2 mol/L硫酸溶液50 μL終止反應(yīng);結(jié)果判定用自動酶標儀讀取OD450值(P/N≥2．1時判定為陽性)。此處的OD450為450 nm波長時的光密度值;P為酶標板各孔的讀值;N為酶標板陰性對照孔的讀值。

本實驗室已制備保存的大菱鲆BSA免疫血清效價檢測:BSA包被、封閉方法同上，將BSA免疫血清作為第一抗體;本實驗制備的兔抗IgM血清(1︰10000)作為第二抗體，其他反應(yīng)同上。

2．5 檢測試紙制備

2．5．1 材料準備

實驗用主要材料為玻璃纖維素膜、AE99硝酸纖維素膜(NC膜)、支持板(購自德國S＆S公司)，氯金酸(由上海化學試劑公司提供)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)(由北京本元正陽基因生物有限公司提供)。另外，X-only單向噴點儀、CM4000切割機、BioDot-TSR 3000讀條儀由美國BioDot公司提供。

2．5．2 多抗的純化

采用辛酸-硫酸銨鹽析法［5］純化由2．3獲得的多抗，即兔IgG。透析后測定其效價水平及蛋白質(zhì)含量，分裝并于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2．5．3 金標抗體及金標抗體玻璃纖維素膜的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金［5］，制備的膠體金顆粒直徑為20 nm。多抗的膠體金標記按照文獻［5］進行，其中膠體金溶液的 pH值為8．5，多抗的標記濃度為0．3 mg IgG每毫升膠體金。

玻璃纖維素膜用正常兔血清完全浸潤以降低其非特異吸附性，43℃干燥3 h后，在干燥器內(nèi)室溫保存?zhèn)溆?。將膠體金標記的多抗溶液用X-only單向噴點儀均勻噴灑于已處理過的玻璃纖維素膜(20 mm ×4 mm)上，43℃干燥3 h后，加入干燥劑密封保存于干燥的室溫環(huán)境。

2．5．4 印膜制備

將NC膜置于噴點儀平臺上，BSA(4 mg/mL)放入貯存池A，SPA(0．8 mg/mL)放入貯存池B。展平NC膜，并放上壓條，開機后將BSA和SPA分別點射于NC膜上形成檢測線和對照線。兩線相距0．5 cm，位于NC膜的中間，距離膜的邊距均為0．75 cm。在室溫下自然干燥后，置于密閉室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2．5．5 試紙的組裝

將NC印膜、金標抗體玻璃纖維素膜(結(jié)合墊)、玻璃纖維素膜(樣品墊)及吸水紙(吸水墊)按照從下到上的順序組裝在不干膠支持板上(見圖1)。將組裝的半成品試紙放入CM4000切割機槽內(nèi)，進行切割，以塑料外殼包裝后制備成品試紙，注明生產(chǎn)日期，放入干燥劑一起密封，置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 檢測試紙各部分組裝結(jié)構(gòu)示意圖Fig．1 Schematic diagram of the test strip showing its several components

2．5．6 試紙工作原理及程序

應(yīng)用試紙進行檢測時，將待檢樣品滴入樣品墊區(qū)，在毛細作用下，滴入的樣品會沿著試紙一直遷移擴散到吸水墊處。當檢測樣品呈陽性時(含抗BSA的IgM，即BSA-IgM)，樣品中待檢測的BSA-IgM會與結(jié)合墊上的金標抗體(兔抗IgM)結(jié)合形成膠體金抗體復(fù)合物，此復(fù)合物會與NC印膜上檢測線處的BSA結(jié)合，并在檢測線區(qū)形成肉眼可見的膠體金紅色條帶。如果檢測線不顯紅色，則說明檢測樣品為陰性。無論檢測樣品是陽性還是陰性，金標抗體都會與NC印膜上對照線處的SPA結(jié)合并顯紅色條帶。

2．5．7 試紙性能測定

1)試紙檢測特異性分析。將已制備的大菱鲆抗BSA抗血清(BSA免疫后1～10周的樣品)以生理鹽水10倍稀釋后作為陽性血清，健康大菱鲆血清以生理鹽水10倍稀釋后作為陰性血清，用生理鹽水作為對照。取100 μL樣品滴加在半成品試紙的樣品墊區(qū)，5 min內(nèi)可裸眼觀察結(jié)果，同時用BioDot-TSR 3000讀條儀對檢測線進行讀值，量化結(jié)果。

2)試紙檢測靈敏度分析。將已制備的大菱鲆抗BSA抗血清從1︰100開始以生理鹽水倍比稀釋以檢驗試紙的靈敏度，健康大菱鲆血清以生理鹽水100倍稀釋后作為陰性血清，用生理鹽水作為對照。取100 μL樣品滴加在半成品試紙的樣品墊區(qū)，5 min內(nèi)可裸眼觀察結(jié)果，同時用BioDot-TSR 3000讀條儀對檢測線進行讀值，量化結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3．1 大菱鲆血清IgM的純化及其兔抗血清的純化

大菱鲆血清經(jīng)過鹽析粗提和過分子篩純化后，再經(jīng)SDS-PAGE檢驗純化后的血清IgM有2個條帶，分子量分別是76 kD和27 kD，代表免疫球蛋白的重鏈和輕鏈(見圖2)，結(jié)果與文獻［6］報道一致。

圖2 純化的大菱鲆血清免疫球蛋白IgM的SDS－PAGE圖譜Fig．2 SDS －PAGE analysis of IgM purified from turbot serum

將純化的大菱鲆血清IgM免疫新西蘭白兔，經(jīng)過4次免疫后，以間接ELISA法檢測兔抗血清效價為1︰256000，將此兔抗血清進一步純化獲得其IgG用于制備檢測試紙，檢測其效價為1︰128000。

3．2 間接ELISA法檢測大菱鲆BSA免疫血清效價

大菱鲆經(jīng)過BSA免疫后，第4周開始產(chǎn)生特異性抗體，抗體效價為1︰800;第5周至第7周抗體水平逐步升高;第8周開始抗體水平升高到1︰51200并維持在這一水平至第10周。

3．3 試紙條的特異性檢測

以組裝后的試紙條檢驗制備保存的大菱鲆BSA免疫血清，結(jié)果顯示，從大菱鲆免疫后第4周開始的血清樣品經(jīng)試紙檢測，其檢測線出現(xiàn)明顯的顯色反應(yīng)，即陽性反應(yīng);試紙條檢測線的顏色反應(yīng)隨著大菱鲆免疫時間的延長而顯色且逐漸加深，其變化趨勢與間接ELISA法檢測結(jié)果一致;其中第10周的顯色與第9周相比較顯得略弱，這與ELISA法檢測時第10周的顯色相對光密度讀值與第9周比較略低相一致。試紙條與健康大菱鲆血清和生理鹽水均呈陰性反應(yīng)。試紙條反應(yīng)結(jié)果經(jīng)BioDot-TSR 3000讀條儀進行讀值量化后見表1。大菱鲆BSA抗體檢測試紙的陽性和陰性兩個檢測代表結(jié)果如圖3所示。

表1 檢測不同樣品后試紙條檢測線的相對光密度值Table 1 The relative optical density(ROD)of test lines on the strip with different samples

圖3 大菱鲆BSA抗體檢測試紙Fig．3 An immunochromatographic strip for the serological detection of antibodies against BSA in turbot，Scophthalmus maximus

3．4 試紙條的靈敏性檢測

組裝后的試紙條與1︰100開始倍比稀釋的大菱鲆BSA免疫血清反應(yīng)，隨著稀釋倍數(shù)的增加，裸眼可見試紙條的顏色反應(yīng)逐漸減弱。以大菱鲆免疫后第九周血清為例，當血清稀釋到1︰25600時顯色為弱陽性，繼續(xù)稀釋則不見顯色反應(yīng)，試紙條檢測結(jié)果與間接ELISA法檢測結(jié)果相當。試紙條與健康大菱鲆血清和生理鹽水均呈陰性反應(yīng)。試紙條反應(yīng)經(jīng)BioDot-TSR 3000讀條儀進行讀值量化后結(jié)果見表2。

表2 檢測不同稀釋梯度的樣品其試紙條檢測線的相對光密度值Table 2 ROD of test lines on the strip with different dilutions of the samples

4 總結(jié)與討論

當前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)正處于高度發(fā)達時期，研究和建立一種簡易、快捷的魚類早期疾病檢測方法是業(yè)界最為迫切的需求之一。研究發(fā)現(xiàn)，在魚類免疫系統(tǒng)中有4種免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，即IgM、IgD、IgT 和 IgZ［7］，其中 IgM 是在真骨魚類中發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的Ig，也就是當前魚類抗體檢測的主要Ig。因此，研究人員可以通過對IgM的檢測實現(xiàn)對魚類疾病的早期診斷?？贵w檢測的優(yōu)勢相對于抗原檢測，因可以在疾病的潛伏期內(nèi)發(fā)現(xiàn)其蹤跡，而受到人們的高度重視。然而，對于IgM的檢測，現(xiàn)有方法的最大不足是步驟繁瑣、周期長，且需專業(yè)人員操作。為此，養(yǎng)殖生產(chǎn)一線人員特別渴望獲得一種操作簡便、可以現(xiàn)場快速檢測的方法，以實現(xiàn)真正意義上的魚病早發(fā)現(xiàn)、早診斷。

據(jù)有關(guān)文獻報道，膠體金具有肉眼可以觀察到的紅色、與多種生物大分子(包括抗原、抗體)結(jié)合后不會影響其活性等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于標記組織和細胞、電鏡分析、免疫斑點滲濾和免疫層析等領(lǐng)域［8～11］。近年來，由膠體金標記物與膜載體相結(jié)合而構(gòu)建完成的膠體金免疫層析檢測試紙，其靈敏性已在畜禽疾病檢測中得到證實，并且迅速發(fā)展成為一種簡便、實用的病害檢測方法而被畜禽界普遍采用。這種檢測試紙現(xiàn)已實現(xiàn)了商品化生產(chǎn)，并顯示出巨大的市場潛力［3］。

本研究吸取了畜牧業(yè)疾病檢測試紙的基本原理和方法，首次制備的魚類疾病檢測試紙已經(jīng)成功地應(yīng)用于水生動物——大菱鲆抗BSA抗體的檢測，其檢測的特異性和靈敏性與ELISA檢測水平相當。由此可見，該項快速檢測技術(shù)的建立將可在海水魚類養(yǎng)殖中普遍推廣應(yīng)用，其不僅可為魚類疾病的早期檢測提供新技術(shù)、新方法，而且可以為疫苗免疫效果的評價提供一種比過去更為便捷、直觀的新方法。

文章建立的大菱鲆BSA抗體檢測試紙之所以具有較高的特異性和敏感性，分析其原因主要與制作試紙所用的材質(zhì)及其處理方法、膠體金標記抗體時采用的pH值和標記的蛋白濃度有關(guān)［12］。本研究選取玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊，將其安置于層析系統(tǒng)的中間，其網(wǎng)格均勻且非特異性吸附低，并具有一定的硬度，能夠很好地負載膠體金標記物和待檢測樣品而不致被吸附;同時對結(jié)合墊進行封閉處理后，可以更好地降低其非特異性吸附及非特異性反應(yīng)。本試驗發(fā)現(xiàn)，當用豬血清IgG對玻璃纖維素膜進行封閉處理時，檢測試紙會發(fā)生非特異性反應(yīng)——即檢測生理鹽水時檢測線會顯色;當用正常兔血清進行封閉處理時，則不會發(fā)生非特異性反應(yīng)。另外，膠體金與標記蛋白之間的電荷引力是實現(xiàn)標記的重要作用力之一，當膠體金溶液的pH值接近標記蛋白的等電點時，兩者的吸附力最強;標記蛋白的濃度是否合適也是影響標記的一個重要因素，蛋白濃度過高會造成一定的浪費，同時容易引起試紙的拖帶現(xiàn)象，反之則會導(dǎo)致膠體金標記不完全，從而降低試紙的靈敏度，并可能出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。通過梯度標記試驗，反復(fù)比較不同標記pH值和標記蛋白的濃度，確定膠體金溶液的pH值為8．5，且多抗的IgG標記濃度為0．3 mg/mL時，即可達到最佳標記效果。

檢測實驗證明，筆者等制備的魚類疾病專用檢測試紙使用方便，檢測快速，可裸眼即時判讀結(jié)果而無需特殊操作技能和儀器設(shè)備的輔助。因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中可用作對疫苗的應(yīng)用效果進行現(xiàn)場快速評估，也可對病害的發(fā)生過程進行實時跟蹤檢測。但是，目前尚存在如下問題期待以后的研究來解決:

1)該試紙尚不能區(qū)分所檢測的抗體是由疫苗誘導(dǎo)抑或自然發(fā)病所產(chǎn)生，如果已知魚體接種過疫苗，則可應(yīng)用該試紙評估抗體產(chǎn)生情況;如已知魚體未接種過疫苗，應(yīng)用該試紙檢出抗體則說明魚體正感染此病或者曾經(jīng)感染過此病。至此目前只能結(jié)合魚體平時表現(xiàn)進行分析再做出最終判斷，實現(xiàn)免除實驗室繁瑣的檢驗過程，為提高病害防控能力贏得寶貴時間。

2)實驗中，試紙的顏色反應(yīng)會隨魚體抗體水平的升高而逐漸加深，即試紙的顏色反應(yīng)與待檢抗體水平存在一定的線性關(guān)系，只通過裸眼觀察尚無法進行定量判斷;所采用的BioDot-TSR 3000讀條儀雖然可以量化結(jié)果，但是操作復(fù)雜，需要有專業(yè)技能，且不便攜帶，限制了野外配合檢測試紙的操作與應(yīng)用。因此，今后需開發(fā)便攜式試紙條閱讀器，以便為終端用戶提供更多的選擇，方可達到獲得定性檢測結(jié)果的同時也可獲得定量檢測的效果，如結(jié)合網(wǎng)絡(luò)運用，則可實現(xiàn)數(shù)據(jù)的遠程傳送。

3)制備的檢測試紙雖已達到了ELISA法的檢測水平，但尚不能在魚體免疫初期即當抗體水平處于較低水平的狀態(tài)下檢出結(jié)果，故今后尚需進一步提高試紙檢測的靈敏度，如采用單克隆抗體技術(shù)則有可能更精準地捕獲靶目標，或者采用信號放大系統(tǒng)，如生物素-親和素系統(tǒng)或免疫金銀染色法進行銀加強等，結(jié)合使用簡易檢測儀器，便可進一步提高檢測靈敏度，以拓寬其檢測范圍。

5 結(jié)語

筆者等應(yīng)用膠體金免疫層析試紙快速檢測技術(shù)，首次在大菱鲆上成功研制出抗體檢測試紙(此抗體檢測試紙已獲得國家實用新型專利授權(quán)，專利號:ZL201120131593．7)，表明該項技術(shù)可以推廣應(yīng)用于魚類病害的抗體檢測，還可以設(shè)計改造制作成病原檢測試紙，為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病(包括真菌性、細菌性、病毒性及寄生蟲性等疾病)的早期診斷和治療提供快捷手段。該項技術(shù)的誕生使養(yǎng)殖生產(chǎn)現(xiàn)場檢測與監(jiān)測疾病早期發(fā)生成為可能，其理論與技術(shù)經(jīng)濟價值很高，應(yīng)用前景廣闊。為了使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域能夠達到快捷、簡便、高效的應(yīng)用階段，應(yīng)該在今后進一步開展精準化檢測試紙的研制與建立。

［1］肖克宇．水產(chǎn)動物免疫與應(yīng)用［M］．北京:科學出版社，2007．

［2］張改平，郭軍慶，李青梅，等．動物疫病免疫試紙快速檢測技術(shù)概況［J］．河南農(nóng)業(yè)科學，2009(9):174-176．

［3］王蔚芳，李青梅，郭軍慶，等．膠體金免疫層析快速檢測技術(shù)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用前景［J］．漁業(yè)科學進展，2010，31(3):113-118．

［4］秦 蕾，王印庚，閻斌倫．大菱鲆微生物性疾病研究進展［J］．水產(chǎn)科學，2008，27(11):598-601．

［5］朱立平，陳學清．免疫學常用實驗方法［M］．北京:人民軍醫(yī)出版社，2000．

［6］魏鑒騰，陳吉祥，王淑嫻，等．大菱鲆血清免疫球蛋白IgM的純化及應(yīng)用研究［J］．中國海洋大學學報，2008，38(6):932-936．

［7］Warr G W．The immunoglobulins and the genes that encode them［J］．Developmental＆ Comparative Immunology，1995，19:1-12．

［8］Faulk W P，Taylor G M．An immunocolloid method for the electron microscope［J］．Immunochemistry，1971，8(11):1081-1083．

［9］Anon K，Paulsen A Q，Tilley M B，et al．Use of electron microscopic and immunogold labeling techniques to determine polyomavirus recombinant VP1 capsid-like particles entry into mouse 3T6 cell nucleus［J］．Journal of Virological Methods，2000，90:91-97．

［10］Zhang L，Volknandt W，Gundelfinger E D，et al．A comparison of synaptic protein localization in hippocampal mossy fiber terminals and neurosecretory endings of the neurohypophysis using the cryo-immunogold technique［J］．Journal of Neurocytology，2000，29(1):19-30．

［11］Brorson S H．A method for measurements of the efficiency of immunogold labeling of epoxy-embedded proteins subjected to different retrieval techniques［J］．Micron，2004，35:619-621．

［12］張付賢，王興龍．免疫膠體金技術(shù)影響因素分析［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(5):199-202．