張溢華 綜述，陳禮剛審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，四川瀘州 646000）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是腦血管疾病、冠脈疾病、周圍動(dòng)脈疾病等諸多血管性疾病的病理基礎(chǔ)，心腦血管疾病的發(fā)生率隨著AS發(fā)病率的增高，而不斷增加，人類身體健康受到嚴(yán)重威脅。研究表明，AS是一種脂質(zhì)介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病［1］，以血管壁內(nèi)脂質(zhì)沉積、炎癥細(xì)胞聚集為特征［2］，免疫反應(yīng)貫穿于AS的始終。Toll樣受體（toll like receptors，TLR）尤其是Toll樣受體4（TLR4）作為一類介導(dǎo)非特異性免疫反應(yīng)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體蛋白，能夠識(shí)別多種病原相關(guān)的分子模式（PAMPs），并能調(diào)控膽固醇的代謝、細(xì)胞凋亡、斑塊的穩(wěn)定性、炎癥和免疫反應(yīng)以及血管重塑等病理過程，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中的作用極其重要，是最近幾年研究較多的模式識(shí)別受體，其在免疫反應(yīng)中作用突出。TLR4能識(shí)別PAMPs并激活炎癥細(xì)胞。TLR4既可識(shí)別外源性配體－革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）同時(shí)也能識(shí)別動(dòng)脈損傷過程中表達(dá)的內(nèi)源性配體。諸多研究表明，TLR與越來越多的臨床疾病關(guān)系密切［3］，在AS的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中，TLR4的作用至關(guān)重要，本文就TLR4的結(jié)構(gòu)功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與AS之間的相關(guān)性作一綜述。

1 TLR4的概述

TLR4是模式識(shí)別受體中研究最多的人TLR，主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起重要作用。TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由24個(gè)亮氨酸重復(fù)序列組成的細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)的序列保守區(qū)3個(gè)部分組成。TLR4位于9q32－33，cDNA長度有3 811bp，包含879個(gè)氨基酸，多表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞、表皮微血管、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人成齦牙纖維細(xì)胞、人子宮頸平滑肌細(xì)胞、呼吸氣道上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等［4］。TLR4作為模式識(shí)別受體，通過胞外區(qū)的亮氨酸重復(fù)序列可使不同的PAMPs被識(shí)別。其既可識(shí)別外源性配體－革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分LPS，同樣也可識(shí)別動(dòng)脈損傷過程中表達(dá)較多的內(nèi)源性配體，從而介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)過程。

2 TLR4如何轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路

2.1 細(xì)胞外部分的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo) 在TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，LPS結(jié)合蛋白（LPS－binding protein，LBP）首先將LPS從細(xì)菌外膜上轉(zhuǎn)移下來，并與其脂質(zhì)A結(jié)合，形成LPSLBP復(fù)合物，該復(fù)合物再與可溶性CD14（sCD14）結(jié)合，形成由這三者構(gòu)成的復(fù)合物。再將復(fù)合物中的LPS傳遞給膜結(jié)合CD14（mCD14），并由mCD14將LPS轉(zhuǎn)運(yùn)并錨定于由TLR4和髓樣分化蛋白－2（myeloid differentiation protein，MD－2）構(gòu)成的受體復(fù)合物［5］，LPS結(jié)合 MD－2后，通過TLR4的細(xì)胞外富含亮氨酸的重復(fù)序列介導(dǎo)TLR4的聚合，進(jìn)而觸發(fā)TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)，LBP和CD14將LPS傳至高密度脂蛋白顆粒，促進(jìn)其失活。

2.2 細(xì)胞內(nèi)部分的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo) 髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLR4信號(hào)通路中重要的接頭蛋白，因此，可以根據(jù)TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是否有MyD88的參與將該信號(hào)通路分為MyD88依賴性（早期反應(yīng)）和非依賴性（遲發(fā)反應(yīng)）信號(hào)通路兩種［6］。前者活化絲裂原激活的蛋白激（mitogen－activated protein kinase，MAPK）和核因子－κB（nuclear factor kappa B，NF－κB）信號(hào)通路，后者活化 NF－κB和干擾素調(diào)節(jié)因子－3（IFN－regulated factor－3，IRF3）信號(hào)通路。通過上述信號(hào)途徑TLR4誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；同樣TLR4也通過激活樹突狀細(xì)胞促進(jìn)抗原遞呈，介導(dǎo)先天性免疫轉(zhuǎn)化為獲得性免疫。

2.2.1 MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 MyD88由氨基端死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）、羧基端TIR結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短的連接序列組成。在MyD88依賴的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，MyD88通過TIR結(jié)構(gòu)域與TLR4的TIR相結(jié)合、通過DD結(jié)構(gòu)域與IRAK（IL－1Rassociated kinase，IRAK）相結(jié)合，導(dǎo)致其自身磷酸化［7］，從而使腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6（tumor necrosis factor associated receptor 6，TRAF6）能與磷酸化的IRAK4－IRAK1結(jié)合，形成復(fù)合物。隨后，IRAK1－TRAF6從TLR4上分離出來，再去激活其他的復(fù)合物，包括轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶（transforming growth factorβactivated kinase，TAK1）、TAK1結(jié)合蛋白1（TAB1）、TAK1結(jié)合蛋白2／3（TAB 2／3），并使其磷酸化。TAK1就能使抑制性的 NF－κB（inhibitor of nuclear factor－κB，I－κB）激酶活化，形成活化的I－κB激酶（IKK）復(fù)合物IKKα、IKKβ、IKKγ，增加I－κB的降解，從而使細(xì)胞核內(nèi)的NF－κB水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)不同促炎癥反應(yīng)基因的表達(dá)增加。通過上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，TLR4介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的激活，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄靶基因，并介導(dǎo)早期的非特異性免疫反應(yīng)。

2.2.2 MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為IRF3和NF－κB的遲發(fā)激活反應(yīng)。TLR4的激活引起TIR的接頭蛋白分子（TRIF，也叫TICAM－1）結(jié)合了細(xì)胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域，TRIF再激活干擾素調(diào)節(jié)蛋白3（IRF3），IRF3與干擾素激活反應(yīng)元件連接，使得靶基因的轉(zhuǎn)錄被激活。有實(shí)驗(yàn)證明，在TRAF缺乏的細(xì)胞中，不能激活Ⅰ型類干擾素，這說明這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是由TRAF介導(dǎo)的。且這一通路也能誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)蛋白－10、糖皮質(zhì)激素衰減反應(yīng)基因－16、干擾素調(diào)節(jié)基因－1表達(dá)和DC的成熟［8］。

3 TLR4與AS的關(guān)聯(lián)性

AS是一種特別的慢性炎癥性疾病，以血管壁內(nèi)炎癥細(xì)胞及脂質(zhì)聚集為特征［9］，其進(jìn)程可被分為若干不同階段，每一個(gè)階段都有不同的細(xì)胞分子學(xué)特征［10］，而由TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)卻貫穿于AS的始終。TLR4胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)與IL－1受體類似，被稱之為 TLR 結(jié)構(gòu)域（Toll／IL－1receptor homologous region，TIR），負(fù)責(zé)受體活化后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在對人及小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的組織切片進(jìn)行免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)［11］，TLR4在粥樣斑塊組織特別是在脂質(zhì)豐富、巨噬細(xì)胞浸潤的部位顯著表達(dá)，并與巨噬細(xì)胞共表達(dá)。另有研究表明，AS患者的斑塊中TLR4表達(dá)增高，且主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞；在載脂蛋白E基因缺陷小鼠AS模型中TLR4基因缺陷斑塊組成改變，降低斑塊中巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)的成分，并明顯降低促炎因子的表達(dá)［12－13］。巨噬細(xì)胞中激活的TLR4能引起一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)炎癥因子、蛋白酶表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成。

3.1 TLR4在AS中的內(nèi)源性配體 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種TLR4的內(nèi)源性配體，例如：脂多糖、熱休克蛋白、纖連蛋白－EDA、硫酸類肝素、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原、mmLDL、泰素、甘露糖醛酸、包膜蛋白、中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、肺炎衣原體HSP60等，且已經(jīng)被證明部分受體在AS的形成中作用至關(guān)重要。纖連蛋白是一種分子量較大的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，作為細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合部位，它能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的組成。在AS患者的動(dòng)脈內(nèi)膜可見纖連蛋白及其變異體，包含額外的結(jié)構(gòu)域A（纖連蛋白－EDA），纖連蛋白－EDA在非AS患者動(dòng)脈中是不存在的［14］。Tan等［15］證實(shí)小鼠纖連蛋白－EDA的缺失可以通過降低致AS的遺傳背景來減少AS的發(fā)生，這個(gè)過程可能是通過降低巨噬細(xì)胞對LDL的攝取來實(shí)現(xiàn)的。在ApoE敲出的小鼠動(dòng)脈損害部位，其纖連蛋白－EDA的mRNA表達(dá)水平升高；另外，血清中EDA的水平也同樣地升高［16］。在細(xì)胞的原代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)纖連蛋白－EDA不但能激活TLR4，而且還能誘導(dǎo)TLR4的表達(dá)［17］。這些研究均說明纖連蛋白－EDA可能是TLR4致AS的內(nèi)源性配體，參與TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

脂類對于AS的發(fā)生發(fā)展中起很大作用，如內(nèi)皮下脂質(zhì)的沉積、巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取以及泡沫細(xì)胞的形成，在脂紋的形成過程中至關(guān)重要。高膽固醇患者巨噬細(xì)胞膜表面的LDL受體水平降低，這提示脂質(zhì)在被巨噬細(xì)胞吞噬之前已經(jīng)發(fā)生氧化。Xu等［18］研究發(fā)現(xiàn)在單核－巨噬細(xì)胞中，與天然的LDL相比氧化型LDL（oxidized LDL，oxLDL）能使TLR4mRNA的表達(dá)水平增加。然而，oxLDL能否結(jié)合并激活TLR4還未被證實(shí)。相反，在樹突狀細(xì)胞中TLR4活化后炎癥因子的產(chǎn)生卻被抑制，這可能是由于I－κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)導(dǎo)致的［19］。oxLDL的早期形式mmLDL能介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白的集合及巨噬細(xì)胞的擴(kuò)散，這依賴于TLR4信號(hào)通路的激活。另外，Miller等發(fā)現(xiàn)mmLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)有一部分依賴于TLR4。直到今天，在AS形成進(jìn)程中，氧化型脂類通過TLR4信號(hào)通路發(fā)揮作用的確切作用是有爭議的。

有多數(shù)熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）已經(jīng)被證實(shí)在AS的過程中起重要作用。HSP屬于分子監(jiān)控蛋白類，在蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用中比較關(guān)鍵。HSP在多種細(xì)胞類型中均有表達(dá)，特別是在處于應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞中表達(dá)較高，例如炎癥、高熱、缺氧等。在ApoE基因敲出、高膽固醇飲食飼養(yǎng)的小鼠與ApoE基因未敲出、正常飲食小鼠相比，前者動(dòng)脈粥樣斑塊中HSP 60和 HSP70表達(dá)增高［17］，在穩(wěn)定的 AS斑塊中HSPmRNA的水平有所衰減［20］。HSP作為TLR4的內(nèi)源性配體，能夠通過TLR4影響AS中產(chǎn)生發(fā)生和發(fā)展。然而，到目前為止對于HSP60和HSP70是如何通過TLR4在AS中產(chǎn)生發(fā)病機(jī)制的研究還不清楚。

雖然許多研究均表明，TLR4的內(nèi)源性配體通過激活TLR4影響AS的發(fā)生和發(fā)展，但是其在影響AS發(fā)生發(fā)展和斑塊的穩(wěn)定性方面的分子機(jī)制不詳。

3.2 TLR4與AS Michelsen等［21］是最早提出TLR4與AS形成是有直接聯(lián)系的。在這個(gè)研究中，TLR4／ApoE都被敲出的小鼠比只有ApoE被敲出的小鼠AS的發(fā)生率小，其內(nèi)膜損傷程度也比MyD88／ApoE都被敲出的輕。在TLR4／ApoE和MyD88／ApoE都被敲出的小鼠中，其抗AS的作用與膽固醇水平幾乎沒有關(guān)聯(lián)。同時(shí)，在TLR4／ApoE和 MyD88／ApoE都被敲出的小鼠AS斑塊中的脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞也顯著降低，這說明TLR4信號(hào)通路在動(dòng)脈粥樣斑塊的發(fā)生發(fā)展中和斑塊穩(wěn)定性中至關(guān)重要。

外向性的重構(gòu)導(dǎo)致血管壁的增生是AS進(jìn)程中的代償性機(jī)制。在外向性重構(gòu)過程中細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，它能夠削減粥樣斑塊的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其不穩(wěn)定性增加容易發(fā)生損傷［22］。Hollestelle等TLR4在血管外向性重構(gòu)中的作用，他們建立了一個(gè)結(jié)扎對此頸動(dòng)脈的小鼠動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)表明，血管的外向性重構(gòu)依賴于TLR4，在TLR4缺乏的小鼠模型沒有出現(xiàn)血管的外向性重構(gòu)。這些證據(jù)均表明，TLR4在血管外向性重構(gòu)的代償機(jī)制和基質(zhì)金屬蛋白酶的活化中都發(fā)揮重要的作用，使粥樣斑塊的不穩(wěn)定性增加。

血管平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣斑塊中重要的產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞，所以它的凋亡將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生減少。TLR4通過Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域依賴的途徑來促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡［23］。最近，Ishikawa等［24］研究發(fā)現(xiàn) TLR4在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）、穩(wěn)定性心絞痛（stable angina，SA）等住院患者破裂的粥樣斑塊中有所表達(dá)。與無缺血性疾病的患者相比，AMI和SA患者都存在全身性的TLR4mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平增高［25］。這些都說明TLR4在動(dòng)脈粥樣斑塊的形成中發(fā)揮重要作用。

4 小結(jié)與展望

AS是一種脂質(zhì)介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，大量的證據(jù)表明TLR4是AS和非特異性免疫之間的重要介質(zhì)。TLR4廣泛地表達(dá)與不同的細(xì)胞類型，與AS的發(fā)病機(jī)理和促AS的配體結(jié)合有關(guān)。TLR4能激活NF－κB轉(zhuǎn)錄因子和促炎性蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性增加。通過對TLR4結(jié)構(gòu)功能、信號(hào)通路及其與AS的關(guān)聯(lián)性研究有助于加強(qiáng)對AS的了解，更明確揭示AS的實(shí)質(zhì)，為防治AS提供新靶點(diǎn)。

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