犬瘟熱診斷技術(shù)

一、范圍

本標準規(guī)定了犬瘟熱的臨床診斷、犬瘟熱病毒的病原分離、免疫酶檢測、免疫組織化學(xué)檢測、RTPCR檢測的操作方法。

二、試劑和材料

2.1 改良最低要素營養(yǎng)液（DMEM）培養(yǎng)基

2.2 非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）

2.3 磷酸鹽緩沖液（PBS）

2.4 青霉素、鏈霉素

2.5 CDV陽性血清：中和抗體效價1·1024。

2.6 CDV陰性血清：無CDV感染的犬血清。

2.7 本科結(jié)合物：HRP標記的葡萄球菌A蛋白（SPA）。

2.8 底物溶液

2.9 過氧化氫甲醇溶液

2.10 鹽酸酒精溶液

2.11 胰蛋白酶溶液

2.12 Taq酶及10倍Taq酶反應(yīng)緩沖液：Taq酶濃度為5U/μL，-20℃保存。

2.13 逆轉(zhuǎn)錄酶及10倍逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液：逆轉(zhuǎn)錄酶濃度為5U/μL，-20℃保存。

2.14 RNA酶抑制劑（40U/ μL）：-20℃保存。

2.15 dNTP：含dATP、dGTP、dTTP各10mmol/L, -20℃保存。

2.16 引物：濃度為20μmol/L,其序列如下：

上游引物（CDVR）：5'CGA GTC TTT GAG ATA GGG TT3'

下游引物（CDVR）：5'CCT CCA AAG GGT TCC CAT GA3'

隨機引物：含有9個堿基的隨機序列引物，濃度為5U/μL，-20℃保存。

DEPC水：自配或購買商品化DEPC水。

Trizol試劑：4℃保存。

異丙醇：使用前預(yù)冷至-20℃。

75%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水配制，使用前預(yù)冷至于20℃。

1.5mL無RNA酶的Eppendorf管。

0.2mL無RNA酶的PCR薄壁管。

三、器材和設(shè)備

3.1 細胞培養(yǎng)瓶（中號瓶）

3.2 二氧化碳培養(yǎng)箱

3.3 恒溫水浴箱（5℃～100℃）

3.4 普通光學(xué)顯微鏡

3.5 0.45μm微孔濾膜

3.6 離心機

3.7 PCR擴增儀

3.8 水平電泳儀

3.9 40個小孔的室玻片

3.10 冷凍切片機

3.11 高速臺式冷凍離心機：可控溫至4℃、離心速度可達12000g以上

3.12 凝膠成像系統(tǒng)

四、臨床檢查

4.1 臨床癥狀

4.1.1 病犬體溫升高至40℃以上，鼻流清涕至膿性鼻汁，膿性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎癥狀。

4.1.2 腹下可見米粒大丘疹。

4.1.3 病后期CDV侵害大腦時則出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，頭、頸、四肢抽搐。

4.2 病理變化

4.2.1 新生幼犬感染CDV表現(xiàn)胸腺萎縮；成年犬多表現(xiàn)結(jié)膜炎、鼻炎、氣管支氣管炎和卡他性腸炎。

4.2.2 表現(xiàn)神經(jīng)癥狀的犬可見鼻和腳墊的皮膚角化病。

4.2.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變包括腦膜充血，腦室擴張和因腦水腫所致的腦脊液增加。

4.2.4 犬瘟熱病毒的包涵體呈嗜酸性，位于胞漿內(nèi)，直徑1μm～5μm，可在黏膜上皮細胞、網(wǎng)狀細胞、白細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)包涵體多位于被覆上皮細胞、腺上皮細胞和神經(jīng)節(jié)細胞。

4.3 判定

若臨床癥狀符合4.1.1或4.1.3且出現(xiàn)4.2.4的病理變化，則可判定疑似犬瘟熱，其他臨床癥狀和病理變化可作為參考指標；疑似病例可采用病毒分離、免疫酶檢測、免疫組織化學(xué)檢測和RT-PCR檢測等方法確診。

五、 病毒分離

5.1 樣品采集和處理

5.1.1 活犬可采集淚液、鼻液、糞便，病死犬可采集肝、脾、肺等組織器官。

5.1.2 上述樣品用無血清DMEM制成20%組織懸液，10000r/ min離心20min，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，濾液用于CDV分離。

5.2 操作方法

5.2.1 細胞培養(yǎng)

用含8%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)瓶（中號瓶）培養(yǎng)Vero細胞，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱，單層細胞長至80%～90%時，接種樣品上清。

5.2.2 病料接種

用0.1mL處理好的樣品上清接種Vero細胞，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱吸附1h，加入無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)5d～7d，觀察結(jié)果。

5.3結(jié)果判定

若接種未出現(xiàn)細胞病變，應(yīng)將細胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代，如仍無細胞病變，則判為CDV病原分離陰性。若Vero細胞培養(yǎng)4d～5d出現(xiàn)細胞病變（如細胞變圓、胞漿內(nèi)顆粒變性和空泡形成，隨后形成合胞體，并在胞漿中出現(xiàn)包涵體），可用免疫酶檢測、免疫組織化學(xué)檢測和RT-PCR三種方法之一進行確診。

六、免疫酶檢測

6.1操作方法

6.1.1 將CDV標準株和待鑒定的樣品分別接種Vero細胞，接種后5d～7d，病變達50%～75%時，用胰蛋白酶消化分散感染細胞，PBS液洗滌3次后，稀釋至1X106個/ mL細胞。取有40個小孔的室玻片，每孔滴加10μL。室溫自然干燥后，冷丙酮（4℃）固定10min。密封包裝，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

6.1.2 取出室玻片，室溫干燥后，每份10倍稀釋的CDV陽性血清和陰性血清，每份血清滴加到兩個病毒細胞孔和一個正常細胞孔，置濕盒內(nèi)，置恒溫水浴箱37℃孵育30min。

6.1.3 PBS漂 洗3次，每次5min，室溫干燥。

6.1.4 滴加1∶100稀釋的酶結(jié)合物，置濕盒內(nèi)，用恒溫水浴箱37℃孵育30min。

6.1.5 PBS漂 洗3次，每次5min。

6.1.6 將室玻片放入底物溶液中，室溫下顯色5min～10min。PBS漂洗2次，再用蒸餾水漂洗1次。

6.1.7 吹干后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，判定結(jié)果。

6.2 結(jié)果判定

6.2.1 若CDV陰性血清與正常細胞和病毒感染細胞反應(yīng)均無色，且CDV陽性血清與正常細胞反應(yīng)無色，與CDV標準毒株感染細胞反應(yīng)呈棕黃色或棕褐色，則判定陰、陽性對照成立。

6.2.2 在符合6.2.1的條件下，待鑒定病毒感染細胞與CDV陽性血清和陰性血清反應(yīng)均呈無色，判為CDV陰性，相應(yīng)動物犬瘟熱感染陰性。

6.2.3 在符合6.2.1的條件下，待鑒定病毒感染細胞與陰性血清反應(yīng)呈無色，而與CDV陽性血清反應(yīng)呈棕黃色或棕褐色，判為CDV陽性，相應(yīng)動物犬瘟熱感染陽性。

七、 免疫組織化學(xué)檢測

7.1 樣品處理

對疑似CD的病死犬或捕殺犬，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴結(jié)和腦等組織，置冰瓶內(nèi)立即送檢。不能立即送檢者，將組織塊切成1cmX1cm左右大小，置體積分數(shù)為10%的福爾馬林溶液中固定、保存、送檢。

7.2 操作方法

7.2.1 新鮮組織按常規(guī)方法制備冰凍切片。冰凍切片機切片風(fēng)干后用丙酮固定10min～15min，新鮮組織或固定組織按常規(guī)方法制備石蠟切片（切片應(yīng)用白膠或鉻礬明膠做粘合劑，以防脫）。

7.2.2 去內(nèi)源酶：用過氧化氫甲醇溶液或鹽酸酒精溶液37℃作用20min。

7.2.3 胰蛋白酶消化：室溫下，用胰蛋白酶溶液消化處理2min，以便充分暴露抗原。

7.2.4 漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。

7.2.5 封閉：滴加體積分數(shù)為5%的新生牛血清或1∶10稀釋的正常馬血清，37℃濕盒中孵育30min。

7.2.6 加10倍稀釋的CDV陽性血清或陰性血清，37℃濕盒中孵育1h或37℃濕盒中孵育30min后4℃過夜。

7.2.7 漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。

7.2.8 加1∶100稀釋的酶結(jié)合物，37℃濕盒孵育1h。

7.2.9 漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。

7.2.10 底物顯色：新鮮配制的底物溶液顯色5min～10min后漂洗。

7.2.11 從90%乙醇開始脫水、透明、封片、普通光學(xué)顯微鏡觀察。

7.2.12 試驗同時設(shè)陽性、陰性血清對照。

7.3 結(jié)果判定

7.3.1 被檢組織與陰性血清作用后應(yīng)無著染，若出現(xiàn)黃色或棕褐色著染，判定陰性對照不成立，應(yīng)重復(fù)實驗。

7.3.2 在符合7.3.1的條件下，被檢組織與CDV陽性血清作用后本底清晰，細胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃色或棕褐色著染，判為CDV陽性，相應(yīng)動物犬瘟熱感染陽性。

八、 RT-PCR檢測

8.1 病料的采集及處理

采集的樣品包括犬的淚液、鼻液、唾液、糞便及病死犬的肝、脾、肺等組織器官。將待檢組織或糞便樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000g離心15min，收集上清液待檢。口腔拭子、糞拭子用少量生理鹽水浸潤后，取上清液待檢。經(jīng)細胞病原分離培養(yǎng)的樣品，收集細胞沉淀待檢。CDV陽性對照樣品和陰性對照樣品的同樣處理。

8.2 RNA抽提

分別取100μL待檢樣品、CDV陽性樣品和陰性樣品的上清液各裝入1.5mL無RNA酶的Eppendorf管，加入1mL Trizol試劑，用槍頭充分吹打20次～30次；13000g離心15min；取上層水相，加500μL異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，-20℃放置20min；13000g離心10min；加20μLDEPC水溶解RNA沉淀。RNA溶液在2h內(nèi)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。另外，RNA抽提也可采用市售的商品化RNA抽提試劑盒進行。

8.3 cDNA模板制備

取17 μLRNA溶液，加10倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液2.5μL、dNTP1.5μL、隨機引物2μL、RNA酶抑制劑1μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，室溫放置10min后，置PCR儀上經(jīng)42℃、60min，70℃、10min。

8.4 PCR檢則

在0.2mLPCR薄壁管中，按每個樣品10倍Taq酶濃縮緩沖液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq酶0.5μL、cDNA模板2μL、上游引物和下游引物（CDVF、CDVR）各0.5μL、三蒸水18.5μL，配制PCR檢則體系。將PCR管置PCR儀上按如下程序擴增：首先94℃、30s，55℃、30s、72℃、40s進行35個循環(huán)；最后72℃、3min。用TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖平板（含0.5μg/mLEB，將平板放入水平電泳儀，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，將10μLPCR產(chǎn)物和2μL加樣緩沖液（6X）混勻后加入樣品孔。在電泳時設(shè)立DNA標準分子量作對照。5V/cm電泳約30min，當(dāng)溴酚藍到達底部時停止，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

8.5 結(jié)果判定

8.5.1 經(jīng)RT-PCR檢測，CDV陽性對照樣品可擴增出大小為455bp的核酸片段，且陰性對照樣品無擴增條帶，否則試驗結(jié)果視為無效。

8.5.2 在符合8.5.1的條件下，若待檢樣品擴增出了大小為455bp的核酸片段，則初步判定犬瘟熱病毒核酸陽性；若待檢樣品無擴增條帶或擴增條帶大小不為455bp，則判定犬瘟熱病毒核酸陰性。

8.5.3 待檢樣品擴增出的陽性基因片段應(yīng)進行核酸序列測定，若其序列與提供的比對序列的同源性≥90%，則可確診為犬瘟熱病毒核酸陽性，否則判定犬瘟熱病毒核酸陰性。

8.5.4 若犬瘟熱病毒核酸陽性且病原分離也呈陽性，則可判定犬瘟熱病毒感染陽性。