王智鼎，宋 艷，孫 麗，孫德軍

(1.吉林大學 藥學院 再生醫(yī)學科學研究所 生物技術藥物教研室，吉林 長春 130021;2.長春遠大國奧制藥有限公司，吉林 長春 130012)

亞甲基藍對豬凝血酶病毒滅活/去除工藝驗證實驗

王智鼎1，宋 艷1，孫 麗2，孫德軍1

(1.吉林大學 藥學院 再生醫(yī)學科學研究所 生物技術藥物教研室，吉林 長春 130021;2.長春遠大國奧制藥有限公司，吉林 長春 130012)

目的 驗證亞甲基藍光化學法滅活豬凝血酶中病毒的滅活效果，完善生產工藝。方法 在SINV、EMCV、PPV和PRV等4種病毒中，加入0.5 mg/L的亞甲基藍置于病毒光照滅活儀上光照2 h和用60 kD膜超濾的滅活病毒方法來驗證工藝的可行性。結果 經亞甲基藍可有效滅活病毒，經超濾法濾除可有效去除病毒。摻入到凝血酶原液中的病毒以及在原培養(yǎng)物中病毒都喪失了對細胞的感染性，降低的滴度TCID50高于4 Log10。結論 亞甲基藍光化學法可有效滅活豬凝血酶中病毒。

凝血酶;亞甲基藍;病毒

凝血酶(Thrombin)是從豬血中提出的促使纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，應用于創(chuàng)口，使血液凝固而止血的藥品［1］。但豬的血液制品中會帶有一些人畜共患病毒原體［2-3］，對藥品的質量和人的健康產生重大的威脅。亞甲基藍因其與細胞膜上的磷脂、蛋白質和核酸結合，經過一定波長的光照后，產生活性氧原子，破壞病毒脂包膜，從而滅活病毒［3-5］。亞甲基藍是一種治療高鐵血紅蛋白血癥的藥品，人每天1～2 mg/kg長期注射沒有明顯的副作用［6］，其光化學法滅活血液成分中病毒的技術在歐美等發(fā)達國家開展多年，在國外已經開始應用于臨床［7］。所以我們在前期工作的基礎上［8-9］，結合動物源性生物制品的特殊要求，選擇了SINV(辛德畢斯病毒)、EMCV(腦心肌炎病毒)、PPV(豬細小病毒)和PRV(偽狂犬病病毒)等4種病毒代表了DNA、RNA、有囊膜和無囊膜病毒及過濾指示病毒，具有較好的代表性，確定作為本試驗的指示病毒，用亞甲基藍0.5 mg/L置于病毒光照滅活儀上光照2 h和用60 kD膜超濾的滅活病毒方法來驗證工藝的可行性。

1 材料

凝血酶原液(批號為100901、100902、100903)，長春遠大國奧藥業(yè)有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素(雙抗)、胰酶，Gibco公司;60 kD超濾管，長春Hyclone科技有限公司。

SINV、EMCV、PPV、PRV、傳代細胞系 PK-15(豬腎細胞)、Vero(非洲綠猴腎細胞)均由本實驗室保存。

2 方法

2.1 病毒制備

按常規(guī)細胞培養(yǎng)方法進行［10］，在細胞培養(yǎng)瓶中用DMEM培養(yǎng)液加10%胎牛血清作為細胞的培養(yǎng)液(pH 7.2)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，在細胞傳代時用0.25%胰酶消化細胞。在PK-15細胞傳代時同步接種PRV和PPV;在Vero細胞生長為單層時接種EMCV和 SINV。接種量為 0.5 mL/瓶(50 mL培養(yǎng)瓶)，連續(xù)培養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯的細胞病變(CPE)后于－20℃和37℃反復凍融3次，收集病毒液。以未接種病毒的細胞作為陰性對照細胞。

2.2 細胞半數(shù)感染量(TCID50)的測定

按常規(guī)方法［11］，將傳代消化后的細胞稀釋成約105～106個/mL后，轉入96孔培養(yǎng)板中，用0.18 mL/孔;待Vero細胞隔夜長成單層后接種EMCV和SINV、PK-15細胞傳代時同步接種PRV和PPV，接毒時將病毒液作連續(xù)的10倍稀釋，每個稀釋度分別接種8孔，0.1 mL/孔，并用生理鹽水作陰性對照，置37℃，5%CO2培養(yǎng)，每天觀察細胞病變并記錄，按Reed-Muench法計算TCID50。

2.3 模擬工藝樣品的制備

2.3.1 亞甲基藍病毒滅活實驗 隨機抽取原液，在超凈臺內打開，每支2 mL凍存管中加入原液1.8 mL;每管再加入指示病毒各0.2 mL(樣品中最終病毒滴度大于6.5Log10)，作為亞甲基藍試驗檢測對照組。再在其中加入亞甲基藍至0.5 mg/L，作為亞甲基藍組。按生產工藝中的病毒滅活/去除工藝樣品進行處理，將摻入病毒標記為亞甲基藍組對照的凍存管，放入病毒滅活光照培養(yǎng)箱，照射2 h，作為下一步病毒滅活效果檢測的樣品。

2.3.2 超濾病毒濾除實驗 隨機抽取原液，在超凈臺內打開，每支2 mL凍存管中加入原液1.8 mL;每管再加入指示病毒各0.2 mL(樣品中最終病毒滴度大于6.5Log10)，用60 kD超濾管進行超濾，作為超濾法滅活效果檢測的樣品，標記為超濾。同時做不摻入病毒的樣品對照、培養(yǎng)基替代原液加入病毒的對照。

2.4 病毒滅活滴度測定

按2.1項下方法將傳代消化后的細胞稀釋成約105～106個/mL后細胞轉入96孔細胞板，血清濃度為2%，Vero細胞貼壁生長后傾去培養(yǎng)基，重新加入培養(yǎng)基0.09 mL后接毒;PK-15細胞按0.09 mL/孔傳代至培養(yǎng)板同步接毒。

3 結果

3.1 兩種病毒原液的制備與滴度測定

分別測定病毒的TCID50。通過倒置顯微鏡觀察，接種EMCV和SINV的Vero細胞接種24 h后出現(xiàn)折光性減弱，部分細胞圓縮、脫落、呈拉網狀，48 h后80%以上的細胞出現(xiàn)CPE，培養(yǎng)液中懸浮大量的脫落壞死細胞;接種PRV和PPV 72 h后的PK-15細胞出現(xiàn)脫落、拉網等明顯的CPE。未接種病毒的Vero和PK-15保持貼壁生長，細胞形態(tài)完整，未發(fā)現(xiàn)有明顯變化。分別接種病毒48 h收集病變的Vero細胞、72 h收集 PK-15細胞培養(yǎng)液，各收獲30 mL，分裝凍存管中，作為本試驗的病毒原液。統(tǒng)計并按 Reed-Muench法計算 TCID50，測定 EMCV的TCID50為 6.71Log10/0.1 mL，PPV 的 TCID50為6.89 Log10/0.1 mL稀釋的病毒液，SINV的 TCID50為6.65Log10/0.1 mL 稀釋的病毒液，PRV 的 TCID50為7.2Log10/0.1 mL 稀釋的病毒液。

3.2 模擬工藝病毒滅活滴度測定

3.2.1 亞甲基藍滅活實驗結果 經亞甲基藍滅活后的樣品加入到培養(yǎng)液中觀察72 h后，對照細胞生長正常。與對照組相比SINV、EMCV和PRV病毒滴度降低4Log10以上，而對無包膜病毒PPV無明顯影響。

3.2.2 超濾濾除病毒實驗結果 經超濾濾除后的樣品加入到培養(yǎng)液中觀察72 h后，對照細胞生長正常。結果與對照組相比SINV、EMCV、PPV和PRV病毒滴度都降低4Log10以上。

4 討論

將SINV、EMCV、PPV和PRV病毒摻入到凝血酶原液后，經亞甲基藍可有效滅活病毒，經超濾法濾除可有效去除病毒。摻入到凝血酶原液中的病毒以及在原培養(yǎng)物中病毒都喪失了對細胞的感染性，滴度降低4Log10以上，而其他對照顯示處理后的注射液對細胞沒有毒性。以上結果說明這兩步工藝均符合《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術審評一般原則［S］GPH3-1》和國食藥監(jiān)注［2008］《關于發(fā)布化學藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術要求的通知》的要求，證明兩種方法均是有效的滅活/去除病毒工藝。

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［11］中華人民共和國農業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品質量標準［S］.北京:中國農業(yè)出版社，2001.

The validation experiments of Methylene blue virus inactivation/removal process on swine thrombin

WANG Zhi-ding1，SONG Yan1，SUN Li2，SUN De-jun1
(1.Department of Biomedicine，Institute of Frontier Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China;2.Yuan Da Guo Ao Pharmacy Co.，Ltd.，Changchun，Changchun 130012，China)

Purpose To test the result of methylene blue virus inactivation/removal process on swine thrombin and to improve the production process.Methods Adding 0.5 mg/L methylene blue on Sindbis virus，of EMCV and PPV and PRV viruses，then putting them in the inactivated virus illumination instrument for 2 hours and using 60 kD ultrafiltration method to validate the feasibility of the process to inactivated virus.Results Methylene blue inactivated and filter virus could effectively remove the virus by ultrafiltration.Viruses which were incorporated into thrombin and in the original culture，lasty lose the ability to cell infection，and reduce the TCID50higher than 4Log10.Conclusion Methylene blue virus inactivation/removal process can effectively inactivate the virus in swine thrombin.

thrombin;methylene blue;virus

TQ464.8

A

1005-1678(2012)06-0797-03

2012-05-28

王智鼎，男，碩士研究生，主要從事生物藥物與分子靶向藥物研究，Tel:0431-85619233，E-mail:wzdfjfn@126.com。