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        基于分子動力學(xué)模擬研究P53-DNA結(jié)合域單點突變對肽段的影響

        2012-08-15 00:54:11許朝瑩
        科技視界 2012年7期
        關(guān)鍵詞:構(gòu)象殘基單點

        許朝瑩

        (山東師范大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院 山東 濟(jì)南 250014)

        0 引言

        P53作為最重要的抑癌基因之一,與癌癥的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系緊密,大約50%的人類癌癥中存在著P53突變。P53定位于人類17p13.1染色體上,由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成,能編碼與核DNA結(jié)合的磷蛋白P53。人類P53蛋白由393 個氨基酸組成,有三個功能區(qū):(1)N 端區(qū)域(1~94);(2)中間疏水區(qū)域 (94~297,DNA Binding Domain,DBD);(3)C 端區(qū)域(297~393)。DBD區(qū)域能直接與DNA結(jié)合,絕大多數(shù)腫瘤中檢查到的P53突變即發(fā)生在該區(qū)域中,由兩個反平行折疊片構(gòu)成一個三明治樣的片層骨架結(jié)構(gòu)。該區(qū)域有四個保守區(qū)域,分別記為Ⅱ-Ⅴ。Ⅳ(234-255)能直接和DNA結(jié)合,單獨存在時沒有嚴(yán)格的二級結(jié)構(gòu),呈無規(guī)則卷曲狀。迄今為止,對P53區(qū)域Ⅳ突變結(jié)構(gòu)及生理功能缺乏深入系統(tǒng)的認(rèn)識,對該肽段與腫瘤致病微觀機(jī)制的聯(lián)系尚不清楚。

        P53蛋白殘基的點突變、缺失以及失活在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的作用。Assaf Friedler等用NMR技術(shù)研究R249S突變對P53結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)突變體的結(jié)構(gòu)與野生態(tài)結(jié)構(gòu)類似,但是β三明治片層骨架結(jié)構(gòu)的柔性增加,DNA結(jié)合平面發(fā)生局部彎曲。Oded Suad等利用實驗檢測R249S、R249S/H168R和R249S/H168R/T123A突變對P53轉(zhuǎn)活功能的影響,發(fā)現(xiàn)R249S突變使DBD區(qū)域結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,與DNA、蛋白質(zhì)之間的相互作用消失;R249S/H168R突變能穩(wěn)定P53-DNA結(jié)構(gòu),能部分恢復(fù)P53的轉(zhuǎn)活功能;R249S/H168R/T123A突變進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

        盡管實驗生物學(xué)對P53突變作了大量研究和統(tǒng)計,對R249殘基突變影響P53結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了一些研究。但是,在原子水平,P53蛋白及其突變區(qū)域的構(gòu)象如何變化?與腫瘤致病微觀機(jī)制有何聯(lián)系?尚沒見到有關(guān)報道。本文利用分子動力學(xué)模擬方法,研究R249S突變對P53-DNA結(jié)構(gòu)的影響。分別對野生型wtP53肽段和單點突變P53-R249S進(jìn)行獨立的分子動力學(xué)模擬,每組模擬300ns。該研究為從分子層次認(rèn)識腫瘤的致病機(jī)制和設(shè)計新的治癌藥物奠定理論基礎(chǔ)。

        1 方法

        P53蛋白的R249殘基位于DBD保守Ⅳ區(qū)域(殘基234-255),選取殘基230-258肽段作為研究對象。分別對wtP53肽段和單點突變P53-R249S肽段兩個體系進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,wtP53肽段的初始結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(代碼為1tsr),R249S突變利用Swiss-pdbviewer軟件實現(xiàn)。

        利用GROMOS軟件和43A1力場,分別對上述體系在NTP系綜下進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。帶電基團(tuán)選用殘基在pH值為7.2下的質(zhì)子化狀態(tài),選用SPC水模型,選擇周期性大小合適的十二面體盒子,溶質(zhì)同盒子邊緣最小間距設(shè)定為0.8nm。靜電作用力用PME計算,其庫倫力閾值定為0.9,范德華相互作用力的勢能距離閾值定為0.9。為使模擬體系保持電中性,wtP53肽段體系加入一個氯離子,P53-R249S體系呈現(xiàn)電中性,不加任何離子。能量優(yōu)化后,約束溶質(zhì)原子,進(jìn)行300ps的約束動力學(xué)模擬,將體系溫度由50K平衡升到300K。使體系均保持在溫度300K、壓強(qiáng)1bar,采用弱耦合作用保持體系的溫度和壓強(qiáng)穩(wěn)定,溫度和壓強(qiáng)的耦合時間常數(shù)均為0.1ps,模擬步長為2fs,進(jìn)行300ns的自由動力學(xué)模擬,每2ps采集一次構(gòu)象。

        2 結(jié)果與討論

        為深入探索生理環(huán)境條件不同殘基突變對P53肽段構(gòu)象穩(wěn)定性的影響,我們計算二組體系的自由能分布和聚類情況。

        利用GROMACS的兩個程序g_covar和g_anaeig對模擬構(gòu)象進(jìn)行主成分分析,選取兩個最大主量PC1和PC2為反應(yīng)坐標(biāo),根據(jù)構(gòu)象分布,用二維直方圖法分別計算二個體系的自由能。自由能定義為-kTlnP(PC1,PC2),其中,k和T分別為波爾茲曼常數(shù)和溫度,P(PC1,PC2)為兩個主量的聯(lián)合概率分布。在圖中,顏色越深,表明相應(yīng)自由能越低、結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,構(gòu)象落到該區(qū)域的概率就越大。不同殘基突變對結(jié)構(gòu)有不同的影響。單點突變型P53-R249S肽段的自由能較低,而野生型P53肽段有一個相對穩(wěn)定的中間態(tài)結(jié)構(gòu)。

        對體系進(jìn)行構(gòu)象聚類(Conformation clusters)分析,確定采樣構(gòu)象的傾向。構(gòu)象聚類基于構(gòu)象之間骨架原子位置的根均方差(Root mean square deviation,RMSD)。在模擬最后100ns輸出的軌跡中,等間隔均勻選取1×104個構(gòu)象作為分析對象,基于構(gòu)象之間的根均方差進(jìn)行聚類。聚類的標(biāo)準(zhǔn)是,如果一個構(gòu)象同某個類里面的任一構(gòu)象之間的根均方差小于0.1nm,那么這個構(gòu)象就屬于該類。通過聚類發(fā)現(xiàn),單點突變型P53-R249S肽段的中心構(gòu)象有α螺旋結(jié)構(gòu),而野生型P53肽段只有β片結(jié)構(gòu)。

        3 結(jié)論

        P53殘基突變是腫瘤病發(fā)的重要因素。為了研究R249S突變對結(jié)構(gòu)的影響,本文選取P53殘基230-258肽段為對象,利用分子動力學(xué)模擬研究其突變對P53肽段的影響。采用GROMACS軟件包、43A1力場和充分含水模型,在生理條件下分別對肽段wtP53和單點突變P53-R249S進(jìn)行300ns的獨立分子動力學(xué)模擬,研究R249S突變對結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:單點突變P53-R249S肽段自由能較低,無中間態(tài),而野生型P53肽段有一個相對穩(wěn)定的中間態(tài)。從原子水平上揭示單點突變P53-R249S肽段和wtP53肽段構(gòu)象差異的動力學(xué)和熱力學(xué)特性,能更好地理解由P53殘基突變引起肝癌的微觀致病機(jī)制,為新藥物設(shè)計提供啟迪。

        [1]Attardi,L.D.;Donehower,L.A.Mutat Res.2005,576(1-2),4.

        [2]Soussi,T.Adv Cancer Res.2011,110,107.

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