殷 剛，周 軍

（1.上海波匯通信科技有限公司，上海 201204；2.上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093）

引 言

眾所周知，腫瘤是致使人類病亡的第二大病因，全球每年癌癥死亡人數(shù)約為700萬人。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，臨床上腫瘤診斷的主要手段是活體組織切片，據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全球每年有上億次活體組織切片診斷，一般過程是用穿刺等方法在身體內(nèi)取出活的組織切片，然后在顯微鏡下作病理診斷。此種方法給患者造成極大的痛苦，患者依從性較差，并且每次診斷需數(shù)天時間，醫(yī)療成本較高，此外制成的切片使細(xì)胞失去了生理狀態(tài)，影響診斷準(zhǔn)確度。與此同時，X光攝片、計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描技術(shù)（computed tomography，CT）、光學(xué)相干層析技術(shù)（optical coherence tomography，OCT）和核磁共振成像技術(shù)（magnetic resonance imaging，MRI）等醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為疾病診斷的常規(guī)手段，大大加快了診斷時間。但是，現(xiàn)有成像技術(shù)的分辨力較低，在癌癥初期階段，腫塊較小不明顯，現(xiàn)有成像技術(shù)由于分辨力限制很難實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，從而錯過了癌癥治療的最佳時期，給患者造成巨大的損失。

上述實(shí)際應(yīng)用需求客觀上推動了結(jié)合醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展以及適合活體組織切片的高分辨力光纖共聚焦顯微鏡的研究開發(fā)。光纖共聚焦顯微鏡的光載體與醫(yī)用軟性纖維內(nèi)窺鏡一樣，都是玻璃光纖，因此具有良好的柔軟性和方便的操作性能。光纖共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢在于它實(shí)際上是一種共聚焦顯微鏡：不僅用激光光源代替了纖維內(nèi)窺鏡的冷光源，而且具有復(fù)雜的光學(xué)成像子系統(tǒng)，即三維掃描系統(tǒng)、光束分離器、用于反射激光聚焦的小孔和一系列校正透鏡組。現(xiàn)有的光纖共聚焦顯微鏡已達(dá)微米級光學(xué)分辨力，完全可以實(shí)現(xiàn)對組織細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞級和亞細(xì)胞級的微觀成像。目前，光纖共聚焦顯微鏡正處于技術(shù)發(fā)展初期［1－2］，國外商業(yè)化的產(chǎn)品有Opticscan公司的Optiscan FIVE1和 Mauna Kea Technologies公司的Cellvizio LAB光纖共聚焦顯微鏡，國內(nèi)的工作主要集中在理論研究［3－5］和皮膚共聚焦樣機(jī)的研制［6－8］，尚無此類產(chǎn)品。

文中重點(diǎn)開展了光纖共聚焦顯微內(nèi)窺鏡活體內(nèi)實(shí)時成像系統(tǒng)的研發(fā)，主要包括光纖共焦顯微鏡和圖像處理子系統(tǒng)。在光纖共焦顯微鏡中，通過激光光源代替冷光源，光纖束傳輸圖像，同時自主設(shè)計(jì)光學(xué)結(jié)構(gòu)，在提高圖像分辨力的前提條件下，減小物鏡端頭的物理尺寸，以達(dá)到活體成像的實(shí)際要求。在圖像處理子系統(tǒng)中，通過線性、非線性圖像匹配和反卷積算子增強(qiáng)等獨(dú)特算法提高圖像的重構(gòu)質(zhì)量。

文中采用光纖共焦顯微技術(shù)，結(jié)合獨(dú)特的圖像重構(gòu)技術(shù)，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，具有圖像分辨力高、探頭物理尺寸小、實(shí)時檢測等多方面優(yōu)勢。

1 共聚焦顯微鏡簡述

共聚焦概念最早由美國學(xué)者M(jìn)arvin Minsky提出，當(dāng)時Minsky在哈佛大學(xué)讀博士后，期間提出了共聚焦顯微鏡的基本概念［9］。1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一臺共焦顯微鏡，用來觀察大腦的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，并于1957年申請了技術(shù)專利［10］。但在當(dāng)時，Minsky的發(fā)明并沒有馬上引起人們的注意，主要原因是沒有足夠強(qiáng)度的光源，并且當(dāng)時計(jì)算機(jī)的能力還不足以處理大量的數(shù)據(jù)。隨著60年代激光的問世，第一臺單光束共聚焦激光掃描顯微鏡在1970年問世。到了90年代，光學(xué)和電子技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了更穩(wěn)定和更強(qiáng)的激光、更高效的掃描鏡片組、更高效能的光纖、更精細(xì)的鍍膜技術(shù)和更低噪音的檢測器。此外，更多的適合固定波段激發(fā)的熒光染料也被不斷地合成，1985年，多個實(shí)驗(yàn)室的多篇報道顯示共聚焦顯微鏡可以消除焦點(diǎn)模糊，得到清晰的圖像；商業(yè)計(jì)算機(jī)處理器速度快速發(fā)展，圖像顯示技術(shù)提高和大容量存儲設(shè)備的產(chǎn)生也推動了共聚焦顯微鏡的發(fā)展［11］，1987年，BIO－RAD公司推出了第一臺商業(yè)化的共聚焦顯微鏡。1993年Gmitro和Aziz首次提出了利用光纖束傳輸掃描的圖像平面和掃描光纖束近端面的光柵，在焦平面上產(chǎn)生樣品的表面圖像，根據(jù)這種思路，光纖共聚焦顯微內(nèi)窺鏡的研究正不斷地進(jìn)行，而且也取得一些很好的結(jié)果。

2 光纖共聚焦顯微內(nèi)窺鏡活體內(nèi)實(shí)時成像系統(tǒng)

2.1 共聚焦顯微鏡的工作原理

如圖1所示：探測光通過小孔后成為點(diǎn)光源，經(jīng)透鏡聚焦到被觀測樣品上，如果樣品恰在焦點(diǎn)上，那么反射光通過原透鏡應(yīng)當(dāng)聚焦回到點(diǎn)光源處，這就是所謂的共聚焦。共焦顯微鏡在反射光的光路上加上了一塊半透半反鏡，將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點(diǎn)上有一個針孔，小孔就位于焦點(diǎn)處，擋板后面是一個光探測器。探測光焦點(diǎn)前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng)，必不能聚焦到小孔上，會被擋板擋住。于是光探測器探測到的就是焦點(diǎn)處的反射光強(qiáng)度。

圖1 共聚焦工作原理Fig.1 The principle of confocal

2.2 光纖共聚焦顯微內(nèi)窺活體實(shí)時成像系統(tǒng)

在傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，引入高速掃描振鏡和超細(xì)傳像光纖束，構(gòu)成光纖共聚焦顯微內(nèi)窺活體實(shí)時成像系統(tǒng)，是癌癥早期診斷的重要工具，系統(tǒng)創(chuàng)新點(diǎn)有：

（1）采用激光光源替代傳統(tǒng)的冷光源，提高系統(tǒng)的光學(xué)分辨力；

（2）采用超細(xì)成像光纖束傳輸圖像，便于活體成像；

（3）物鏡成像系統(tǒng)中引入集成化光學(xué)設(shè)計(jì)，大大減小其尺寸；

（4）圖像拼接技術(shù)采用了微分幾何的大尺度形變理論，消除全景圖像的幾何畸變，實(shí)現(xiàn)高分辨力顯示；

（5）針對具體醫(yī)學(xué)診斷圖像形態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，大大減少診斷醫(yī)生的人工介入。

圖2是光纖共聚焦顯微內(nèi)窺活體實(shí)時成像系統(tǒng)的光路圖，該系統(tǒng)包括有：激光光源照明系統(tǒng)、分光棱鏡、高速掃描振鏡、掃描透鏡、超細(xì)傳像光纖束、物鏡、光纖共聚焦光譜分析系統(tǒng)和圖像分析與重構(gòu)系統(tǒng)。光源照明系統(tǒng)提供的激光光源進(jìn)入至共聚焦掃描單元，掃描單元起到光路掃描的作用；從掃描單元出射后，經(jīng)過掃描透鏡組耦合至超細(xì)傳像光纖束內(nèi)的單根光纖，此單根光纖不僅起到傳輸光的目的，同時起到小孔的作用；光從此光纖出射后傳輸至物鏡，再由物鏡出射至探測樣品上。探測樣品上產(chǎn)生的熒光再通過物鏡、超細(xì)傳像光纖束、掃描透鏡組、共聚焦掃描單元和分光棱鏡傳輸至光纖共聚焦光譜分析系統(tǒng)內(nèi)，再通過主機(jī)內(nèi)的圖像分析與重構(gòu)系統(tǒng)完成圖像重構(gòu)。光纖共聚焦顯微內(nèi)窺活體實(shí)時成像系統(tǒng)能夠提高生物影像的圖像分辨力，同時重構(gòu)的圖像更接近于細(xì)胞組織真實(shí)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。該系統(tǒng)橫向分辨力取決于傳象光纖束內(nèi)相鄰光纖的間距和物鏡的放大倍數(shù)［12］，其關(guān)系如下：

圖2 光纖共聚焦顯微內(nèi)窺鏡活體內(nèi)實(shí)時成像系統(tǒng)光路圖Fig.2 Optical system of in vivo real－time fiber confocal endomicroscopy imaging system

式（1）中，d為橫向分辨力，i為成像光纖內(nèi)相鄰光纖的間距，m為物鏡放大倍數(shù)。

圖3 光纖共聚焦顯微內(nèi)窺鏡活體內(nèi)實(shí)時成像系統(tǒng)框圖Fig.3 Block diagram of in vivo real－time fiber confocal endomicroscopy imaging system

圖3為光纖共聚焦顯微內(nèi)窺鏡活體內(nèi)實(shí)時成像系統(tǒng)框圖，其中，激光器波長為405nm，該波長的近紫外光能激發(fā)熒光探針，便于觀察組織結(jié)構(gòu)。超細(xì)的成像光纖束采用了日本藤倉公司的FIGH－10－500N，該成像光纖由10 000根光纖有序排列組成，其直徑僅為0.6mm。由于采用了超細(xì)的成像光纖束，在臨床上可以利用人體的自然管道進(jìn)入人體，達(dá)到腫瘤早期診斷的目的，并可以明顯減少病人的不適感。為了得到組織結(jié)構(gòu)的實(shí)時三維重構(gòu)圖，需要對組織結(jié)構(gòu)采用三維高速掃描技術(shù)。該系統(tǒng)中，對于二維斷層橫向掃描，采用快速振鏡結(jié)合慢速振鏡，達(dá)到實(shí)時成像的目的，縱向掃描采用水壓控制系統(tǒng)?？焖僬耒R采用Cambridge Technology公司的CRS系類的諧振性快速掃描振鏡，其諧振頻率為8 000Hz，慢速振鏡采用Cambridge Technology公司6230H型振鏡。圖4為光纖共聚焦顯微內(nèi)窺鏡活體內(nèi)實(shí)時成像系統(tǒng)觀察到的老鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞。

圖4 老鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞Fig.4 Colonic mucosa cell of a mouse

3 結(jié) 論

光學(xué)探測技術(shù)不斷地應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)的活體組織病理學(xué)實(shí)時檢測中，傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡能在細(xì)胞水平上觀測組織結(jié)構(gòu)，可以應(yīng)用到如皮膚、牙齒等組織結(jié)構(gòu)。但是，由于其形態(tài)特征，不能進(jìn)入體內(nèi)，所以不能對體內(nèi)的組織成像和不能為腫瘤的早期診斷提供依據(jù)。現(xiàn)研發(fā)的光纖共聚焦顯微內(nèi)窺活體內(nèi)實(shí)時成像系統(tǒng)采用超細(xì)的光纖束傳輸圖像和高速掃描振鏡，同時自主設(shè)計(jì)光學(xué)結(jié)構(gòu)，在提高圖像分辨力的前提條件下，減小物鏡端頭的物理尺寸，以達(dá)到對體內(nèi)活體組織的實(shí)際成像要求。圖像處理可提高圖像的重構(gòu)質(zhì)量，系統(tǒng)具有圖像分辨力高、探頭物理尺寸小、實(shí)時檢測等多方面優(yōu)勢。

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