關(guān) 萍，于業(yè)輝，王 惠，張 梅，張立軍＊

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

植物的胰蛋白酶抑制劑（trypsin inhibitor，TI）是對(duì)胰蛋白酶（trypsin，TP）具有抑制作用的一類多肽類物質(zhì)，它對(duì)植物本身具有保護(hù)作用，可防止植物籽粒自身發(fā)生分解代謝，使種子處于休眠狀態(tài)，能調(diào)節(jié)植物蛋白質(zhì)的合成與分解等［1］。近年來，TI成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)，主要原因?yàn)榍靶┠晔艿狡毡殛P(guān)注的TI抗蟲效應(yīng)和近些年TI對(duì)高等動(dòng)物和人類的治病與致病的雙重效應(yīng)：①TI的抗蟲效應(yīng)。TI能顯著抑制昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，可誘導(dǎo)中腸TP活力的增高，使正常消化過程蛋白酶間的協(xié)調(diào)性破壞，導(dǎo)致昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育受阻［2］，利用TI基因進(jìn)行抗蟲轉(zhuǎn)基因植物育種已被證明是一種行之有效的方法［3-4］；②TI的臨床應(yīng)用。利用TI治療急性胰腺炎［5］，應(yīng)用于外科手術(shù)的促凝血作用［6］，TI的抗腫瘤作用［7］等；③TI的過量攝入對(duì)高等動(dòng)物和人類的危害。TI可引起胰腺增生，TP過量分泌，導(dǎo)致消化不良、生長(zhǎng)停滯，甚至危及生命［8］。這3個(gè)研究方面的既獨(dú)立又相關(guān)。轉(zhuǎn)TI抗蟲基因必然會(huì)造成TI的過量表達(dá)，如果這種植物是高等動(dòng)物或人類的主要食物來源，過量表達(dá)的TI攝入動(dòng)物機(jī)體后，能否對(duì)機(jī)體造成有害影響？Hilder V A等［9］報(bào)道，昆蟲消化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能均與高等動(dòng)物有所不同，隨食物進(jìn)入高等動(dòng)物胃內(nèi)的TI會(huì)在胃蛋白酶和胃酸的作用下被分解而完全失活，因此不會(huì)影響動(dòng)物體的正常生理過程，但該結(jié)論缺乏詳細(xì)的試驗(yàn)研究。Feng G H等［10］報(bào)道，TI的適量攝入對(duì)機(jī)體無害而有益，但這種結(jié)論過于籠統(tǒng)，TI對(duì)高等動(dòng)物治病還是致病，與動(dòng)物的機(jī)能狀態(tài)和攝入劑量密切相關(guān)，不能一概而論。可以肯定的是，對(duì)于正常高等動(dòng)物，機(jī)體內(nèi)過量存在的TI會(huì)對(duì)正常新陳代謝活動(dòng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，值得探討的是TI在隨食物攝入動(dòng)物體，通過胃內(nèi)消化在胃蛋白酶和胃酸作用下分解和活性保持程度如何？本研究的目的在于解決這個(gè)問題，詳細(xì)研究高等動(dòng)物隨食物攝入不同劑量的TI，在胃蛋白酶和胃酸作用下，TI活性的變化及對(duì)動(dòng)物體主要消化道和消化腺TP活性和分泌的影響。分析高等動(dòng)物消化系統(tǒng)對(duì)TI的分解程度，試圖建立TI的攝入劑量與TP活性的關(guān)系，從而為尋求TI的安全劑量、TI的臨床應(yīng)用、作用機(jī)理分析等相關(guān)研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡昆明種SPF級(jí)小鼠160只，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重33g左右，性別隨機(jī)，按雌雄分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑 胰蛋白酶抑制劑為沈陽(yáng)大東銀河鑫試劑公司產(chǎn)品；小鼠胰蛋白酶ELISA檢測(cè)試劑盒為上海滬峰試劑公司產(chǎn)品；氯化鈉為市售。

1.1.3 儀器與用具 酶標(biāo)儀，高速離心機(jī)，組織勻漿器，微量取樣器，電子天平，小鼠灌胃器等，由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院專業(yè)實(shí)驗(yàn)室和畜牧獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的常規(guī)培養(yǎng) 培養(yǎng)地點(diǎn)為沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)主樓動(dòng)物飼養(yǎng)室，晝夜室溫14℃～22℃，飼養(yǎng)室保證陽(yáng)光充足但不曝曬，空氣流通性良好，室內(nèi)濕度保持在50%～70%，每籠小鼠數(shù)量不超過4只，每隔24h添加更換一次食物和飲用水，每隔24h更換一次墊料，每隔48h消毒飼養(yǎng)室地面。

1.2.2 試驗(yàn)分組和給藥方法 試驗(yàn)開始前將小鼠隨機(jī)分配為8組，每組20只，對(duì)照組（急性試驗(yàn)）～高劑量TI組（急性試驗(yàn)）用于試驗(yàn)1.2.3，以下簡(jiǎn)稱為對(duì)照組（AE）～高劑量TI組（AE）。

對(duì)照組（AE）（生理鹽水組），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)食進(jìn)水后0.5h左右，每只試驗(yàn)動(dòng)物通過灌胃途徑給予生理鹽水0.1mL（以下給藥方法同對(duì)照組）。低劑量TI組（AE）：給予7.5×10-3mg／mL TI 0.1mL；中劑量TI組（AE）：給予2.25×10-2mg／mL TI 0.1 mL；高劑量TI組（AE）：給予3.75×10-2mg／mL TI 0.1mL。

對(duì)照組（慢性試驗(yàn)）～高劑量TI組（慢性試驗(yàn)）用于試驗(yàn)1.2.4，以下簡(jiǎn)稱為對(duì)照組（CE）～高劑量TI組（CE）：

對(duì)照組（CE）（生理鹽水組）：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日固定時(shí)間進(jìn)食進(jìn)水后1h左右，每只試驗(yàn)動(dòng)物通過灌胃途徑給予生理鹽水0.1mL（以下給藥方法同對(duì)照組（CE））。低劑量TI組（CE）：給予7.5×10-3mg／mL TI 0.1mL；中劑量 TI組（CE）：給予2.25×10-2mg／mL TI 0.1mL；高劑量 TI組（CE）：給予3.75×10-2mg／mL TI 0.1mL。

1.2.3 急性試驗(yàn) 通過測(cè)定TP活性反映一個(gè)胃排空周期胃內(nèi)消化對(duì)TI分解程度，將對(duì)照組（AE）～高劑量TI組（AE）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照1.2.1方法正常培養(yǎng)7d后，試驗(yàn)前1d晚22時(shí)后停止供食，試驗(yàn)當(dāng)天6：00左右恢復(fù)供食供水，觀察試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)食進(jìn)水情況，正常進(jìn)食進(jìn)水后撤去剩余食物和水0.5h后按照1.2.2方法給藥，給藥4h后將試驗(yàn)小鼠脫臼法處死，迅速取其十二指腸段。組織稱重后備用（十二指腸段禁止反復(fù)沖洗以保存腸腔內(nèi)容物）。根據(jù)所取組織重量加入適量生理鹽水，用勻漿器制成100 g／L組織勻漿，高速離心機(jī)9 000r／min離心10 min，取上清液備用。

應(yīng)用小鼠胰蛋白酶ELISA檢測(cè)試劑盒，按照說明書步驟操作：配制TP標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。測(cè)量4組每只小鼠十二指腸TP的OD值，計(jì)算酶含量。

1.2.4 慢性試驗(yàn) 未分解TI對(duì)胰腺TP活性及分泌影響，將對(duì)照組（CE）～高劑量TI組（CE）組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照1.2.1方法正常培養(yǎng)7d后，開始給藥前編號(hào)并稱量體重，按1.2.2方法給藥。培養(yǎng)28d后，停止供食12h，停止供水6h，稱量體重后脫臼法處死。迅速取其胰腺，組織勻漿制備和TP測(cè)量方法同1.2.3。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析結(jié)果以（±sD）表示，組間差異顯著性采用單因素方差分析和多重比較（LSD和Games-Howell）。

2 結(jié)果

2.1 TI作用下小鼠體重變化

試驗(yàn)開始前為每只小鼠編號(hào)、稱重，試驗(yàn)后處死前重新稱重，計(jì)算試驗(yàn)前體重平均值、試驗(yàn)后體重平均值和體重增長(zhǎng)平均值，結(jié)果見表1。

表1 TI對(duì)小鼠體重的影響Table 1 Effects of TI on body weight in mice

2.2 標(biāo)準(zhǔn)酶液OD值的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

應(yīng)用小鼠胰蛋白酶ELISA檢測(cè)試劑盒，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.001 6x-0.001 4（R2=0.991 5）（表2和圖1）。

表2 胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品含量和OD值的關(guān)系Table 2 The relationship between trypsin standard content and OD value

圖1 胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 trypsin standard curve

2.3 TI作用下小鼠十二指腸內(nèi)容物及腸壁內(nèi)TP活性影響

應(yīng)用小鼠胰蛋白酶ELISA檢測(cè)試劑盒，測(cè)量對(duì)照組（AE）～高劑量TI組（AE）每個(gè)樣品十二指腸TP OD值，根據(jù)回歸方程計(jì)算酶活性（表3）。

表3 TI對(duì)十二指腸內(nèi)容物和腸腺TP活性的影響Table 3 Effects of TI on duodenal contents and midgut gland TP in mice

2.4 TI作用下胰腺TP活性和分泌變化

應(yīng)用小鼠胰蛋白酶ELISA檢測(cè)試劑盒，測(cè)定對(duì)照組（CE）～高劑量TI組（CE）每個(gè)樣品胰腺TP OD值，根據(jù)回歸方程計(jì)算酶活性（表4）。

表4 TI對(duì)胰腺TP活性的影響Table 4 Effects of TI on pancreas TP in mice

3 討論

由表1分析可知，對(duì)照組（CE）小鼠試驗(yàn)前后體重增加1.6g±0.34g，低劑量TI組（CE）體重下降0.26g±2.24g，中劑量TI組（CE）下降0.69g±2.61g，高劑量TI組（CE）增加0.06g±4.78g。相對(duì)于對(duì)照組（CE），低、中、高劑量 TI組（CE）3組體重下降值差異顯著（P＜0.05）。體重可作為動(dòng)物在一定時(shí)期新陳代謝活動(dòng)是否正常的初步判定指標(biāo)，因此不同劑量TI的攝入可初步判定均對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的生理活動(dòng)產(chǎn)生了負(fù)面影響導(dǎo)致體重增加下降，這與研究報(bào)道是一致的［8］。由表3分析可知，十二指腸內(nèi)容物及腸腺中TP活性對(duì)照組（AE）為144.62 pg／mL±57.17pg／mL，低劑量 TI組 （AE）為138.38pg／mL±33.23pg／mL，中劑量TI組（AE）為119.64pg／mL±56.77pg／mL，高劑量 TI組（AE）為107.09pg／mL±49.50pg／mL。相對(duì)于對(duì)照組（AE），低劑量 TI組（AE）顯著下降（P＜0.05），中、高劑量 TI組（AE）極顯著下降 （P＜0.01），TI劑量與IP活性呈正相關(guān)性。可以得出的結(jié)論是，在一個(gè)胃排空周期內(nèi)不同劑量的TI均未被胃內(nèi)消化完全分解并不同程度的抑制了TP活性，這與Hilder V A的研究報(bào)道不同［9］。由表4分析可知，由于TI的長(zhǎng)期過量作用，胰腺TP活性和分泌量發(fā)生了顯著或極顯著變化，這種變化與給藥劑量不呈正相關(guān)性。對(duì)照組（CE）為342.12pg／mL±35.80pg／mL，低劑量 TI組（CE）為 279.86 pg／mL±10.72pg／mL，中劑量 TI組為 （CE）391.32pg／mL±21.93pg／mL，高劑量 TI組為（CE）360.10pg／mL±22.56pg／mL，低劑量 TI組（CE）TP活性極顯著低于對(duì)照組（CE）（P＜0.01），中劑量TI組（CE）極顯著高于對(duì)照組（CE）（P＜0.01）而高劑量TI組（CE）的IP含量則顯著高于對(duì)照組（CE）（P＜0.05）。這種結(jié)果的產(chǎn)生是由于，一方面TI可直接抑制消化系統(tǒng)中的TP活性，另一方面TI可直接作用于胰腺導(dǎo)致TP的過量分泌，表4顯示的TP活性為這兩種作用的協(xié)同效應(yīng)［11］。中、高劑量TI組（CE）均表現(xiàn)為刺激分泌效應(yīng)大于抑制作用，而低劑量TI組（CE）則表現(xiàn)為抑制作用占優(yōu)勢(shì)。TP作為高等動(dòng)物消化過程中發(fā)揮主要作用的消化酶［12］，TP含量發(fā)生顯著的變化勢(shì)必會(huì)對(duì)消化過程產(chǎn)生負(fù)面影響，因此仍具有部分活性的TI直接影響了高等動(dòng)物體的消化過程進(jìn)而影響到整體新陳代謝是顯而易見的。

本研究通過不同劑量TI在一個(gè)胃排空周期對(duì)消化系統(tǒng)中TP活性的急性作用和一個(gè)繁殖周期的慢性作用，總結(jié)出通過攝食途徑進(jìn)入高等動(dòng)物體的TI對(duì)TP活性和分泌的影響及動(dòng)物機(jī)體的整體影響，為目前開展關(guān)于TI的相關(guān)研究（轉(zhuǎn)TI抗蟲基因植物對(duì)高高動(dòng)物消化能力的影響、TI的臨床治療使用劑量及給藥途徑等）提供了理論依據(jù)，但本文僅提供了初步研究結(jié)果，TI攝入后的降解過程、TI的攝入劑量與動(dòng)物致病性的關(guān)系及TI對(duì)機(jī)體作用的機(jī)理分析等還需深入研究和探討。

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