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        PEG 介導(dǎo)細(xì)胞融合最適條件的探討

        2012-08-14 08:01:26白洪志
        關(guān)鍵詞:異源蟾蜍同源

        王 惠,郭 峰,關(guān) 超,張 梅,關(guān) 萍*,白洪志

        (1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧沈陽(yáng)110866;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院,遼寧沈陽(yáng)110866)

        細(xì)胞融合(cell fusion),又稱細(xì)胞雜交,是指在外力的作用下2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞融合成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象,因此又稱細(xì)胞雜交。細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞遺傳、基因定位、細(xì)胞免疫、病毒、腫瘤和培育生物新品種的重要手段[1-3],尤其是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新研究技術(shù)有著更為重大的實(shí)踐意義[4-7]。細(xì)胞融合的方法包括仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)法、物理融合技術(shù)(電融合技術(shù))、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)法等。其中PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合以其容易制備、活性穩(wěn)定、不需要特別的儀器設(shè)備、操作方便等優(yōu)點(diǎn),被普遍用于生物、遺傳、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域[8-9]。但 該 方 法 也 受 許 多 因 素 的 影 響[10-15],如PEG濃度、融合溫度、融合時(shí)間等。

        本試驗(yàn)選取雞紅細(xì)胞、兔紅細(xì)胞、蟾蜍紅細(xì)胞作為同源與異源細(xì)胞研究的試驗(yàn)材料,從PEG濃度、融合溫度、融合時(shí)間三個(gè)方面進(jìn)行單因素探索,以期找到融合率最高時(shí)的條件,達(dá)到更好的融合效果。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 試劑 不同濃度的PEG(Mr=4 000):250、500、750mL/L PEG;380g/L檸檬酸鈉;8.5g/L生理鹽水;GKN液;Hanks液;750mL/L酒精。

        1.1.2 儀器 電子天平,恒溫水浴鍋,低速離心機(jī),微量移液槍,光學(xué)顯微鏡。

        1.2 方法

        1.2.1 不同濃度PEG的配制 稱取少許PEG(Mr=4 000)放入小燒杯中,沸水浴加熱,使其熔化,分別移取等量的3份至刻度試管中,待冷至50℃時(shí),分別加入預(yù)熱的3倍體積、1倍體積、1/3體積的GKN液,混勻,配成250、500、750mL/L的PEG。

        1.2.2 紅細(xì)胞的采取及細(xì)胞懸液的制備 用滅菌的注射器吸入38g/L的檸檬酸鈉2mL,從用750 mL/L酒精消過(guò)毒的雞翼靜脈處(兔是從耳緣靜脈處,蟾蜍是從主動(dòng)脈弓處)采取靜脈血轉(zhuǎn)入事先裝有38g/L的檸檬酸鈉的燒杯中使檸檬酸鈉與血液的體積比為1∶4,放入4℃冰箱中保存。

        取懸液1mL移入10mL的刻度離心管內(nèi),加入8.5g/L生理鹽水4mL混勻,1 500r/min離心5 min;棄上清液(用吸管吸去),加8.5g/L生理鹽水至5mL,混勻后1 500r/min再離心5min;重復(fù)上述操作,再離心洗滌1次;收集最后一次離心沉淀的紅細(xì)胞,用手指輕彈底壁使沉淀松散[9]。用微量移液器移取細(xì)胞沉淀至干凈試管中,加入9倍體積的GKN液,配成100mL/L的細(xì)胞懸液。

        1.2.3 細(xì)胞融合的方法 試驗(yàn)分6組進(jìn)行,同源3組,異源3組,分別為雞-雞、兔-兔、蟾蜍-蟾蜍、雞-兔、雞-蟾蜍和兔-蟾蜍的紅細(xì)胞融合,每組10只試管進(jìn)行單因素試驗(yàn),篩選出每組融合的最佳條件。

        1.2.3.1 PEG濃度對(duì)同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探索 分別取紅細(xì)胞懸液200μL(同源組取200μL,異源組則分別取異源的兩種紅細(xì)胞各100 μL)至3個(gè)刻度離心管中,分別加入預(yù)熱的100μL的250、500、750mL/L的PEG,放于37℃水浴鍋內(nèi)溫浴5min后,再分別加入Hank's液5mL,靜置2 min以終止PEG的作用;用微量移液器移取少量紅細(xì)胞懸液至血球計(jì)數(shù)板上,蓋上蓋玻片,觀察紅細(xì)胞融合情況。

        1.2.3.2 融合時(shí)間對(duì)同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探索 分別取紅細(xì)胞懸液200μL(同1.2.3.1)至3個(gè)刻度離心管中,分別加入預(yù)熱的100μL上一項(xiàng)試驗(yàn)中融合率最高時(shí)的PEG,放于37℃水浴鍋內(nèi)溫浴5、10、15min后,再分別加入 Hank's液5 mL,終止PEG的作用,觀察紅細(xì)胞融合情況。

        1.2.3.3 融合溫度對(duì)同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探究 分別取紅細(xì)胞懸液200μL(同1.2.3.1)至3個(gè)刻度離心管中,分別加入預(yù)熱的100μL上一項(xiàng)試驗(yàn)中融合率最高時(shí)的PEG,分別放于23℃、30℃、37℃、44℃水浴鍋內(nèi)溫浴上一項(xiàng)試驗(yàn)中測(cè)得的融合率最高時(shí)的融合時(shí)間,再分別加入Hank's液5 mL,終止PEG的作用,觀察紅細(xì)胞融合情況。

        1.2.4 細(xì)胞融合率的計(jì)算 在顯微鏡視野里,每個(gè)視野下讀取計(jì)數(shù)板中間大方格中四角中方格及中心中方格中融合的細(xì)胞及未融合的細(xì)胞數(shù)(注意區(qū)分融合細(xì)胞與重疊細(xì)胞[16]),用下面的公式計(jì)算每方格內(nèi)的融合率,取平均值。

        融合率=融合的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%[17]

        2 結(jié)果

        2.1 PEG介導(dǎo)的紅細(xì)胞融合的最適條件探索

        2.1.1 PEG濃度對(duì)同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探索 在37℃、5min融合時(shí)間處理?xiàng)l件下,各種類型同源、異源紅細(xì)胞融合時(shí),PEG為250mL/L的融合率最低,PEG為750mL/L的融合率次之,PEG為500mL/L的融合率最高,其中,同源紅細(xì)胞融合中,以兔同源紅細(xì)胞融合率最高為37.8%,異源紅細(xì)胞融合中,以兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率最高為11.1%(表1)。

        表1 不同濃度PEG同源、異源紅細(xì)胞融合率Table 1 Cell fusion rates of isogenous,heterogenous erythrocytes in different PEG concentrations %

        2.1.2 融合時(shí)間對(duì)同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探究 在PEG 500mL/L、37℃處理?xiàng)l件下,各種類型同源、異源紅細(xì)胞融合時(shí),融合時(shí)間5min的融合率最低,10min的融合率次之,15min的融合率最高(蟾蜍例外,在10min融合率最高)。其中,同源紅細(xì)胞融合時(shí),以兔同源紅細(xì)胞融合率最高為38.2%,異源紅細(xì)胞融合中,以兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率最高為12.7%(表2)。

        表2 不同融合時(shí)間同源、異源紅細(xì)胞融合率Table 2 Cell fusion rates of isogenous,heterogenous erythrocytes in different response time %

        2.1.3 融合溫度對(duì)同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探究 在融合時(shí)間15min、PEG 500mL/L條件下,各種類型同源、異源紅細(xì)胞融合時(shí),融合溫度23℃的融合率最低,30℃的融合率次之,37℃的融合率最高,溫度升高至44℃時(shí),融合率反而下降。其中,同源紅細(xì)胞融合時(shí),以兔同源紅細(xì)胞融合率最高為39.3%,異源紅細(xì)胞融合時(shí),以兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率最高為14.0%(表3)。

        2.2 條件分析

        2.2.1 PEG濃度對(duì)紅細(xì)胞融合效果的影響 根據(jù)PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理可知,PEG是乙二醇的多聚化合物,存在一系列不同分子量的多聚體。在不同濃度PEG溶液中,由于PEG-水之間的氫鍵結(jié)合,導(dǎo)致兩個(gè)細(xì)胞接觸點(diǎn)的質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組和疏散,由于兩細(xì)胞接口處質(zhì)膜的雙分子層之間的相互親和以及彼此的表面張力作用,從而促使細(xì)胞發(fā)生融合,理論上,所用PEG濃度越高,細(xì)胞融合效果應(yīng)該越好。由表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,PEG為500 mL/L時(shí),紅細(xì)胞融合率最高,而PEG為750mL/L對(duì)細(xì)胞的毒性過(guò)大,試驗(yàn)過(guò)程也顯示PEG為750 mL/L時(shí)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生大的變化,出現(xiàn)部分細(xì)胞破碎。

        表3 不同融合溫度同源、異源紅細(xì)胞融合率Table 3 Cell fusion rates of isogenous,heterogenous erythrocytes in different reaction temperature %

        2.2.2 融合時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞融合效果的影響 由表2可知,蟾蜍同源紅細(xì)胞融合組的最適融合時(shí)間是10min,其余組均為15min,但仔細(xì)分析數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn),每組10min與15min時(shí)的融合率差距并不是很大。因此,可知融合時(shí)間對(duì)雞紅細(xì)胞的融合率影響不很明顯,融合率不隨時(shí)間的推移發(fā)生顯著變化,這是由于PEG誘導(dǎo)細(xì)胞的膜間發(fā)生接觸、黏連,使細(xì)胞開(kāi)始融合,經(jīng)離心去除PEG后,黏連的細(xì)胞便隨融合的進(jìn)程自然進(jìn)行所致。

        2.2.3 融合溫度對(duì)紅細(xì)胞融合效果的影響 由表3可知,各種類型同源、異源紅細(xì)胞融合時(shí),均表現(xiàn)隨著溫度的升高,融合率逐漸增高,在37℃時(shí)融合率達(dá)到最大,此后隨著溫度繼續(xù)升高,融合率開(kāi)始下降。理論研究可知,在一定范圍內(nèi),細(xì)胞脂雙層膜會(huì)隨著溫度的升高而流動(dòng)性增強(qiáng)。流動(dòng)性的增強(qiáng)也有益于細(xì)胞間細(xì)胞膜的融合,提高融合率,但過(guò)高溫度也會(huì)使細(xì)胞因承受不了高溫而失去活性,引起融合率降低。尤其是當(dāng)融合的細(xì)胞是蟾蜍類的冷血?jiǎng)游飼r(shí),其紅細(xì)胞對(duì)溫度更為敏感。

        2.3 融合率的差異性分析

        2.3.1 同源組融合率的差異性分析 同源紅細(xì)胞融合時(shí),雞同源紅細(xì)胞在PEG為500mL/L、37℃、15min條件下,融合率7.0%;兔同源紅細(xì)胞在PEG為500mL/L、37℃、15min條件下,融合率39.3%;蟾蜍同源紅細(xì)胞在PEG為500mL/L、37℃、10min條件下,融合率10.8%。都是最適條件,但融合率差距較大。從幾何學(xué)的角度分析可以知道,兔紅細(xì)胞呈球形,可以減少運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力,因此球形細(xì)胞比橢球形運(yùn)動(dòng)速度快,與其他細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)大大增高,導(dǎo)致融合率比橢球形的雞紅細(xì)胞、蟾蜍紅細(xì)胞都高。且在相同細(xì)胞密度下,細(xì)胞體積越大,細(xì)胞間碰觸的機(jī)會(huì)也高,這也是雖外觀都為橢球形,但蟾蜍紅細(xì)胞融合率高于雞紅細(xì)胞的原因。

        2.3.2 異源組融合率的差異性分析 異源紅細(xì)胞融合時(shí),在最適條件下,雞-兔異源紅細(xì)胞融合率為10.4%,雞-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率為6.2%,兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率為14.0%。雞-兔異源紅細(xì)胞、兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合效果都略高于雞、蟾蜍同源時(shí)的融合效果,其原因均可歸結(jié)為兔紅細(xì)胞具有球形外觀,其本身的運(yùn)動(dòng)性高于其他兩種細(xì)胞,因此使得異源細(xì)胞間的接觸機(jī)會(huì)高于雞與蟾蜍同源接觸機(jī)會(huì),且在兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合時(shí),視野下可看到由于兔與蟾蜍紅細(xì)胞體積差距5倍左右,一個(gè)蟾蜍紅細(xì)胞可同時(shí)與多個(gè)兔紅細(xì)胞接觸并進(jìn)一步融合,使融合率有所提升。但整體可看出異源細(xì)胞間的融合率明顯低于同源間,分析原因,可能由于不同物種間的差異性造成的。

        綜上,從單因素試驗(yàn)及結(jié)果分析中可以看出,除蟾蜍同源紅細(xì)胞融合組的最適融合條件為PEG為500mL/L、37℃、10min反應(yīng)時(shí)間,其余組,無(wú)論是恒溫動(dòng)物還是變溫動(dòng)物紅細(xì)胞,其細(xì)胞融合的最適條件均為PEG 500mL/L、37℃、15min反應(yīng)時(shí)間。但從融合率上可見(jiàn)兔紅細(xì)胞同源融合率遠(yuǎn)高于其他各組,而整體上同源組的融合率高于異源組。

        3 討論

        本試驗(yàn)采用雞、兔、蟾蜍紅細(xì)胞為原材料取材既簡(jiǎn)單方便又新鮮可行,且一次性采血量較大,可滿足大量學(xué)生使用,成本不會(huì)增加。就融合條件而言,PEG最適濃度為500mL/L,這是由于PEG濃度過(guò)高時(shí),其細(xì)胞反應(yīng)液體環(huán)境黏滯度過(guò)高,可能會(huì)阻礙細(xì)胞融合。最適溫度37℃,高于30℃,這是因?yàn)殡S著溫度升高,細(xì)胞膜的流動(dòng)性增強(qiáng),有益于融合,而過(guò)高溫度也會(huì)使細(xì)胞因承受不了高溫而失去活性,引起融合率降低。而10min與15min反應(yīng)時(shí)間的融合率差距并不是很大,對(duì)紅細(xì)胞的融合率影響不太明顯,融合率不隨時(shí)間的推移發(fā)生顯著變化,這是由于PEG誘導(dǎo)細(xì)胞的膜間發(fā)生接觸、黏連,使細(xì)胞開(kāi)始融合,經(jīng)離心去除PEG后,黏連的細(xì)胞便隨融合的進(jìn)程自然進(jìn)行所致。

        PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合以其容易制備、活性穩(wěn)定、不需要特別的儀器設(shè)備、操作方便等優(yōu)點(diǎn),被普遍用于生物、遺傳、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域。因此,對(duì)PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的最適條件探究顯得尤為必要。相信隨著研究的不斷深入,細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣[18],產(chǎn)生的影響也日益顯著。

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