司 唯，姚 琳，賈立軍，鞠玉琳

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133002）

附紅細胞體?。ê喎Q附紅體?。┦怯筛郊t細胞體（Eperythrozoon）寄生于紅細胞表面或游離于紅細胞內(nèi)、血漿、組織液及腦脊液中引起的以發(fā)熱、溶血性貧血和黃疸為主要特征的人獸共患病［1-2］。豬附紅細胞體病嚴重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，逐漸被人們所重視。由于各個年齡段、各種品種的豬均能感染豬附紅細胞體病，且仔豬發(fā)病率高，死亡率也高，如不能及時有效地控制該病的傳播，無疑會給養(yǎng)豬業(yè)帶來十分慘重的代價［3］。所以，明確豬附紅細胞體病的傳播途徑就成為了防治該病工作中的重中之重。針對這一現(xiàn)狀，我們試圖采用接觸感染（皮膚涂抹）、口服感染、傷口感染、皮下注射感染和呼吸道感染等5種途徑進行試驗，以確定豬附紅細胞體病的傳播途徑，為豬附紅細胞體的防治提供可靠資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及病原體 昆明小鼠70只，20g～22g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。紅細胞的豬附紅細胞體感染率達95%以上的血液樣本，按照姚琳［4］方法制備紅細胞泥。

1.1.2 試劑與儀器 地塞米松（5mg／mL）為鄭州卓峰制藥有限公司產(chǎn)品；姬姆薩染色原液。低速離心機（DL-5-B），立式滅菌器（ES-315），電子天平（FA／JA1104），顯微鏡（OLYMPUS），通風櫥。

1.2 方法

1.2.1 病原體的檢測 按照參考文獻［5-7］的方法對病原體分別進行血液壓滴標本檢測、姬姆薩染色檢測和PCR檢測。

1.2.2 小鼠感染豬附紅細胞體試驗 將35只小鼠隨機分為7個組，每組5只，進行感染豬附紅細胞體試驗。7個小組分別為皮下組、皮膚組、口服組、傷口組、呼吸道組、呼吸道空白組以及空白組。小鼠腹腔注射地塞米松（0.2mL／只），2d1次，共3次。皮下組、皮膚組和口服組：分別采用皮下、皮膚、灌胃途徑接種0.5mL／只的紅細胞泥。傷口組：采用體側(cè)薄皮部劃痕接種方法接種0.5mL／只的紅細胞泥，劃痕長度為1cm～2cm?？瞻捉M：皮下注射0.5 mL／只生理鹽水。呼吸道組：5只小鼠和紅細胞泥一并放置于密閉的通風櫥內(nèi)一側(cè)，其中將紅細胞泥放置于冰盒上的平皿中7d，每6h更換一次冰袋。呼吸道空白組：條件同上，但不放置紅細胞泥。在上述條件下用相同的方法另選35只小鼠做相同的試驗，但感染小鼠的紅細胞泥劑量為0.2mL／只。連續(xù)30d由小鼠尾部采血制成鮮血壓滴標本，在400倍鏡下觀察并記錄、統(tǒng)計豬附紅細胞體在小鼠體內(nèi)的消長情況曲線。

1.2.3 紅細胞感染情況觀察及計數(shù)方法 顯微鏡下選擇5個視野分別觀察豬附紅細胞體的感染情況，觀察紅細胞形態(tài)及紅細胞表面豬附紅細胞體的形態(tài)、大小、折光性并以百分率來表示感染率。

2 結(jié)果

2.1 病原體檢測結(jié)果

2.1.1 血液壓滴標本檢查 經(jīng)對感染豬附紅細胞體的豬血進行血液壓滴標本檢查，感染豬附紅細胞體的紅細胞邊緣不整，呈星芒狀、鋸齒狀、菠蘿樣形狀，紅細胞內(nèi)和血漿中可見豬附紅細胞體，大多呈球形、逗號形、條形細小顆粒狀，豬附紅細胞體在鏡下有折光性，并且紅細胞表面有黑色疤痕，紅細胞感染率達到95%以上。

2.1.2 姬姆薩染色標本檢查 經(jīng)對感染豬附紅細胞體的豬血進行姬姆薩染色標本檢查，在1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察到紅細胞一般呈紫紅色，豬附紅細胞體則是在紅細胞體上可見藍紫色的具有折光性的疤痕。

2.1.3 PCR擴增 以膜蛋白OxaA為引物，對血液樣本進行PCR檢測，部分臨床樣本PCR檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知，血液樣本2、5、6、9分別在386bp處擴增出較亮的電泳條帶，其他樣本均未擴增出任何條帶，說明樣本2、5、6、9可以作為病原體血液樣本。

選取經(jīng)3種方法共同檢測出的病原體為本試驗的陽性血液。

圖1 血液樣本的PCR鑒定Fig.1 PCR analysis of the blood samples

2.2 小鼠感染豬附紅細胞體試驗結(jié)果

2.2.1 小鼠感染紅細胞泥劑量0.5mL／只的結(jié)果

小鼠在注射地塞米松后，除空白組，各試驗組小鼠均在感染豬附紅細胞體后，在第3天出現(xiàn)食欲減退，精神沉郁，弓背聳毛的現(xiàn)象，第21天以后小鼠的精神狀態(tài)、食欲趨于正常?？瞻捉M小鼠精神狀態(tài)和食欲等均正常。30d內(nèi)的小鼠感染豬附紅細胞體的觀察結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，5個感染試驗組分別在不同程度上感染了豬附紅細胞體，其中傷口組和口服組在第3天開始感染豬附紅細胞體，第6天時皮膚組、皮下組和呼吸道組都呈上升趨勢。在感染過程中發(fā)現(xiàn)傷口組和皮下組在第9天達到感染高峰并且傷口組的感染率最高，達到了96%。皮下組的感染高峰為20%；口服組、呼吸道組和皮膚組在第12天均出現(xiàn)感染高峰，感染率分別達到了89%、80%和19%。傷口組在第12天到第15天感染率急劇下降，直至第27天感染率為0；口服組和呼吸道組從第12天開始均呈現(xiàn)下降的趨勢，分別從第27天和第21天感染率降為0。

圖2 小鼠感染豬附紅細胞體（0.5mL／只）情況Fig.2 The infection situation of E.suis（0.5mL）in mice

2.2.2 小鼠感染紅細胞泥劑量0.2mL／只的結(jié)果

小鼠在免疫抑制后，除空白組之外，各試驗組小鼠均在感染豬附紅細胞體后第5天出現(xiàn)食欲減退，精神沉郁，弓背聳毛的現(xiàn)象，第20天以后小鼠的精神狀態(tài)、食欲趨于正常。空白組小鼠精神狀態(tài)和食欲等均正常。30d內(nèi)的小鼠感染豬附紅細胞體的觀察見圖3。

圖3 小鼠感染豬附紅細胞體（0.2mL／只）情況Fig.3 The infection situation of E.suis（0.2mL）in mice

由圖3可知，5個感染試驗組分別在不同程度上感染了豬附紅細胞體，其中傷口組和口服組在第3天開始感染豬附紅細胞體，第6天時皮膚組和呼吸道組出現(xiàn)感染情況，皮下組在第9天的時候出現(xiàn)感染情況。在感染過程中發(fā)現(xiàn)傷口組第12天達到感染高峰并且該組的感染率最高，達到了75%；口服組和呼吸道組在第18天和第15天出現(xiàn)感染高峰，感染率分別達到了35%和39%；皮下組在第18天達到高峰，感染率為41%。傷口組、皮膚組和呼吸道組在第15天開始感染率急劇下降，分別在第24天、第18天和第21天降為0；口服組從第18天開始均呈現(xiàn)均勻下降的趨勢，第27天感染率降為0。

3 討論

綜合本試驗結(jié)果，傷口組的小鼠從第3天開始感染豬附紅細胞體，第9天出現(xiàn)感染高峰，感染率達到96%，此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于傷口處于表皮層，豬附紅細胞體通過皮下組織與真皮交界處的深部血管網(wǎng)直接進入動脈。口服組小鼠通過灌胃途徑在第12天感染率達89%，此結(jié)果的產(chǎn)生可能是豬附紅細胞體進入消化系統(tǒng)后通過消化道黏膜、黏膜下膜、肌膜和漿膜進入毛細血管，最終進入全身血液循環(huán)，該組感染模型的維持時間最長的原因也許是該組小鼠感染的豬附紅細胞體在體內(nèi)滯留時間較長所導(dǎo)致的。呼吸道組小鼠感染率在第12天達到高峰，感染率為80%，這一結(jié)果也許是因為豬附紅細胞體通過小鼠呼吸系統(tǒng)進入肺部的毛細血管進而進入肺動脈，最后進入全身血液循環(huán)。皮膚組小鼠感染率較低，僅為19%，并且維持時間較短，出現(xiàn)這一結(jié)果可能是由于豬附紅細胞體通過表皮滲透而進入小鼠體內(nèi)，但是由于表皮無血管所以只有微量的豬附紅細胞體進入小鼠體內(nèi)。但皮下組是經(jīng)過皮下注射而感染的，其感染率與皮膚組相近，感染率為20%，與皮膚組僅差1%，所以皮膚組的感染途徑不容忽視。

豬附紅細胞體病屬于一種季節(jié)性疾?。?］，多發(fā)性季節(jié)為9、10月份。在不同的季節(jié)致病性強弱也不同［9］。本試驗中的各試驗組所用的血液樣本采自3月份和6月份，并不是在該病多發(fā)的季節(jié)采取，至于在多發(fā)性季節(jié)采取的血液樣本會不會出現(xiàn)與該試驗相同的結(jié)果還需要進一步的探討。小鼠在感染第18天以后均出現(xiàn)體內(nèi)的豬附紅細胞體逐漸減少直至第27天完全消失的情況，其原因之一為免疫抑制劑隨著時間的延長而失效；其二，隨著時間的延長小鼠的免疫力得到恢復(fù)所導(dǎo)致。

通過觀察兩次不同劑量的試驗所得到的結(jié)果，我們可以看出感染0.2mL／只豬附紅細胞體的小鼠的感染率明顯低于感染0.5mL／只豬附紅細胞體的小鼠的感染率，并且出現(xiàn)感染的時間較后者晚2d，其消亡的時間則早于后者1d。這可能是由于兩次試驗給予小鼠的豬附紅細胞體的劑量差異所導(dǎo)致，說明豬附紅細胞體劑量不同感染率也不同。

本試驗結(jié)果證明，當小鼠免疫力低下時，易感豬附紅細胞體，并且通過皮下、皮膚、口服、傷口、呼吸道5種途徑都可感染，這說明豬附紅細胞體在一定條件下會危害人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。因此獸醫(yī)工作者、屠宰場工作人員、飼養(yǎng)員等應(yīng)加強自身防護。本試驗為該病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。

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［4］ 姚 琳，張守發(fā)，賈立軍，等.豬附紅細胞體有效消毒藥的體外初步篩選試驗［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（9）：125-128.

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