張勤文，俞紅賢，李 莉，荊海霞，魏 青，牛海林，薛 乾，梁 林

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，青海西寧810016）

大通牦牛是利用我國特有野牦牛遺傳資源培育成功的第一個國家級牦牛新品種，也是世界上第一個牦牛培育新品種。其具有穩(wěn)定的遺傳性，較高的產(chǎn)肉性能，特別是有較強的抗逆性和對高寒草場的利用能力，對于我國牦牛的改良及促進區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展都具有重要意義［1］。

有學(xué)者研究表明［2-4］，大通牦牛在生長發(fā)育過程肌酸激酶顯著高于平原黃牛，表明其在高原低氧環(huán)境中，通過增強無氧代謝，增強糖酵解速率、肌肉收縮供能等滿足機體能量代謝的需要。魏青［5］對不同發(fā)育階段大通牦牛和平原黃牛肺泡結(jié)構(gòu)進行比較后發(fā)現(xiàn)，高原牦牛出生時肺泡發(fā)育較完全，具有良好的呼吸功能，大通牦牛在出生后肺泡表現(xiàn)出快速發(fā)育的結(jié)構(gòu)特點。但現(xiàn)有研究中，對大通牦牛骨骼肌組織學(xué)結(jié)構(gòu)報道較少，尤其對大通牦牛骨骼肌適應(yīng)高原低氧環(huán)境的組織學(xué)特點未見報道。為此，選取大通牦牛作為研究對象，并以平原黃牛為對照，通過光鏡和電鏡研究方法，借助計算機圖像分析及形態(tài)計量術(shù)等方法研究成年大通牦牛骨骼肌的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及其適應(yīng)高原低氧環(huán)境的結(jié)構(gòu)特征，以豐富高原動物對低氧環(huán)境的適應(yīng)性的研究內(nèi)容，也為牦牛形態(tài)學(xué)研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機選取青海大通種牛場（海拔3 200m）成年牦牛（以下簡稱大通牦牛）和山東省萊蕪地區(qū)（海拔500m以下）成年黃牛（以下簡稱平原黃牛）各5頭，臨床健康，不計性別。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌肌纖維直徑和表面積密度的測定試驗動物現(xiàn)場屠宰后立即取材。每頭牛取臂三頭肌、股四頭肌、腓腸肌、背最長肌、腰肌和膈肌六個部位的肌肉，所有試驗動物取材部位相同。采取的組織用40mL／L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm間隔連續(xù)切片，HE染色。每例標本選5張組織切片，Olympus BX51顯微鏡下觀察，Olympus DP 70圖像采集系統(tǒng)取圖，分別在100倍和400倍的放大倍率下，選取不重疊、不斷裂的清晰視野，共選30個視野。用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)直接測量數(shù)據(jù)，在400倍視野下測量肌纖維直徑，以圖片中心為中心點做一個“十”字交叉線，測量交叉線所經(jīng)過的所有完整肌纖維的直徑，測量時以每條肌纖維橫切的中點做十字交叉線，測兩條線長度的平均值作為肌纖維的直徑；在100倍的放大倍率下，以數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右為原則，計數(shù)拍攝圖片內(nèi)的肌纖維數(shù)，然后換算為1mm2的肌纖維數(shù)，作為被測樣本的肌纖維密度。

1.2.2 骨骼肌線粒體部分參數(shù)的測定 剖檢時在試驗牛股四頭肌取組織一塊，修成1mm3大小，25 mL／L戊二醛和鋨酸雙重固定，取材時避開血管、脂肪組織，所有供試牦牛取材部位相同。丙酮脫水，Epon812包埋，LKB-2188超薄切片機70nm超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色。制成透射電鏡樣品，JEM-1230透射電鏡觀察并拍照。

參照鄭富盛等［6］相關(guān)計算方法，用正方形網(wǎng)格測試系統(tǒng)以點計數(shù)法測算線粒體體積密度（volume density，VV，單位體積骨骼肌中線粒體的體積密度）、面積密度（surface density，SV，單位體積骨骼肌中線粒體外膜的面積密度）、面數(shù)密度（numerical density on area，NA，單位面積中骨骼肌中線粒體的數(shù)目）等各結(jié)構(gòu)參數(shù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 所測得肌纖維直徑、表面積密度及電鏡圖片測得的各結(jié)構(gòu)參數(shù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標準差（±sD）表示，并對大通牦牛肌纖維直徑、表面積密度及線粒體各結(jié)構(gòu)參數(shù)與平原黃牛相應(yīng)參數(shù)進行t檢驗，計算差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌肌纖維光鏡結(jié)構(gòu)及計量學(xué)分析結(jié)果

由圖1和圖2可見，大通牦牛骨骼肌肌纖維結(jié)構(gòu)致密，明顯細于平原黃牛骨骼肌，相同面積內(nèi)肌纖維個數(shù)明顯多于平原黃牛。由表1可知，成年大通牦牛肌纖維直徑平均值為37.67μm±2.76μm，不同部位間，成年大通牦牛膈肌肌纖維直徑最大，股四頭肌纖維直徑最?。怀赡昶皆S牛肌纖維直徑平均值為45.14μm±2.54μm，不同部位間，成年平原黃牛膈肌肌纖維直徑最大，腰肌肌纖維直徑最小。成年大通牦牛與成年平原黃牛肌纖維直徑，無論是平均值還是不同部位肌纖維直徑相比，均差異極顯著（P＜0.01）。

由表1可知，成年大通牦牛肌纖維密度介于388根／mm2～596根／mm2之間，不同部位間，成牛大通牦牛腰肌肌纖維表面積密度最大，膈肌肌纖維表面積密度最小；成年平原黃牛肌纖維密度介于329根／mm2～512根／mm2之間，不同部位間，成年平原黃牛腰肌肌纖維表面積密度最大，膈肌肌纖維表面積密度最小。

成年大通牦牛與成年平原黃牛肌纖維表面積密度，無論是平均值還是不同部位肌纖維密度相比，均差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 大通牦牛骨骼肌（HE，400×）Fig.1 The skeletal muscle of Datong yak（HE，400×）

圖2 平原黃牛骨骼?。℉E，400×）Fig.2 The skeletal muscle of plain cattle（HE，400×）

表1 大通牦牛與黃牛骨骼肌肌纖維直徑及表面積密度對比Table 1 Comparison of skeletal muscle fiber diameter and surface area density between yaks and cattle

2.2 肌纖維超微結(jié)構(gòu)及形態(tài)計量學(xué)分析結(jié)果

成年大通牦牛骨骼肌細胞中線粒體平均截面積和平均體積小于成牛平原黃牛，差異極顯著（P＜0.01）；而成年大通牦牛骨骼肌細胞中線粒體體積密度、面積密度、面數(shù)密度均大于成年平原黃牛，差異極顯著（P＜0.01）（表2和圖3～圖6）。

表2 大通牦牛與黃牛骨骼肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)參數(shù)值Table 2 The mitochondrial structural parameter values between yak and cattle

圖3 成年大通牦牛骨骼肌細胞線粒體分布情況（10 000×）Fig.3 The distribution of mitochondria in skeletal muscle cells of adult yak（10 000×）

圖4 成年大通牦牛骨骼肌細胞線粒體一般結(jié)構(gòu)（30 000×）Fig.4 The general structure of mitochondria in skeletal muscle cells of adult yak（30 000×）

圖5 成年平原黃牛骨骼肌細胞線粒體分布情況（10 000×）Fig.5 The distribution of mitochondria in skeletal muscle cells of adult plain cattle（10 000×）

圖6 成年平原黃牛骨骼肌細胞線粒體一般結(jié)構(gòu)（20 000×）Fig.6 The general structure of mitochondria in skeletal muscle cells of adult plain cattle（20 000×）

3 討論

3.1 大通牦牛骨骼肌肉質(zhì)分析

川井田博［7］研究證明，肌束內(nèi)肌纖維數(shù)是判定肉質(zhì)細嫩程度重要的因素，無論是屠宰活重或日齡大小，都是以肌纖維愈細者，其肉質(zhì)愈鮮嫩。Cassens R G等［8］研究則表明，肌肉橫截面紋理是肌束排列的組織學(xué)表現(xiàn)，肌束內(nèi)肌纖維愈細，肌纖維密度就愈大，肉品品質(zhì)優(yōu)良。隨著人類生活水平的提高，越來越多的人開始關(guān)注飲食健康，在本試驗結(jié)果中，大通牦牛骨骼肌肌纖維直徑和表面積密度與平原黃牛比較，表現(xiàn)為肌纖維直徑細，表面積密度大的特點，差異極顯著（P＜0.01），說明成年大通牦牛較平原黃牛肉質(zhì)細嫩，品質(zhì)較好，營養(yǎng)價值高。此結(jié)果與張永輝等［9］對大通牦牛肉的營養(yǎng)品質(zhì)分析，冶成君［10］對大通牦牛肉所做的肉質(zhì)綜合評價結(jié)果一致。

3.2 大通牦牛骨骼肌顯微結(jié)構(gòu)特點

成年大通牦牛骨骼肌肌纖維直徑明顯比成年平原黃牛細，表面積密度則大于平原黃牛，差異極顯著（P＜0.01）。這可能與牦牛的生活環(huán)境有關(guān)，大通牦牛的放牧地平均海拔在3 200m以上，環(huán)境氧分壓低，骨骼肌肌纖維受缺氧環(huán)境的影響，表現(xiàn)為骨骼肌肌纖維直徑比平原黃牛細，表面積密度比平原黃牛大的特點。此結(jié)果與孫竹瓏等［11］報道的九龍牦牛肌纖維直徑細于中國黃牛的結(jié)果一致。Kiessling A等［12］研究表明，缺氧環(huán)境會影響肌纖維的生長，表現(xiàn)為肌纖維的長度和直徑增長緩慢，說明高原低氧環(huán)境對大通牦牛骨骼肌的生長發(fā)育有一定的影響。

3.3 大通牦牛骨骼肌線粒體適應(yīng)低氧的結(jié)構(gòu)特點

線粒體是氧化代謝產(chǎn)生能量的主要細胞器，通過氧化磷酸化過程來給組織提供能量，當(dāng)輕、中度低氧條件下，線粒體可以通過機體的有機調(diào)節(jié)來對低氧環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)，適應(yīng)的結(jié)果會導(dǎo)致線粒體的數(shù)目增多，體密度增大［13-15］。齊新章等［16］對高原鼢鼠和高原鼠兔心臟對低氧環(huán)境適應(yīng)的研究表明，高原鼢鼠和高原鼠兔心肌線粒體面數(shù)密度多、面積密度大，從而提高了心肌組織對氧的攝取和利用能力。本試驗結(jié)果顯示，兩種動物的骨骼肌細胞線粒體參數(shù)存在差異性。成年大通牦牛骨骼肌細胞線粒體平均體積小于成年平原黃牛，差異極顯著（P＜0.01）。而線粒體體積密度、面積密度、面數(shù)密度均大于成年平原黃牛，且差異極顯著（P＜0.01）。因此推測可能是為了適應(yīng)高原低氧環(huán)境，大通牦牛在長期進化過程中，通過減小線粒體平均體積，增加骨骼肌線粒體面數(shù)密度、面積密度、體積密度來提高其在低氧環(huán)境中對氧的利用，以提高肌肉組織對氧的利用，以適應(yīng)高原低氧環(huán)境和自身運動的需要。

［1］ 陸仲麟.充分利用野牦牛遺傳資源培育牦牛新品種—青海高原牦牛新品種《大通牦?！酚N配套技術(shù)［C］.甘肅蘭州：全國畜禽遺傳資源保護與利用學(xué)術(shù)研討會論文集，2005：364-366.

［2］ 李 莉，俞紅賢，沈明華.不同發(fā)育期黃牛有氧和無氧代謝相關(guān)指標的測定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2008，40（5）：74-76

［3］ 沈明華.不同發(fā)育期牦牛血清中Fe3＋ 含量和CK活性的測定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2008，40（5）：105.

［4］ 常建軍，李 莉，俞紅賢.生長期牦牛血清和組織中LDH活性的測定［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（7）：1694-1696.

［5］ 魏 青.不同發(fā)育階段高原牦牛和平原黃牛肺泡顯微結(jié)構(gòu)的研究［D］.青海西寧：青海大學(xué)，2009：1-48

［6］ 鄭富盛.細胞形態(tài)立體計量學(xué)［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1990：1-88.

［7］ 川井田博.豬肉肌纖維粗細與肉質(zhì)的關(guān)系［J］.郁明發(fā)，譯.國外畜牧學(xué)：豬與禽，1983（3）：51-54

［8］ Cassens R G，Rymkiewicz J，Szeremeta J，et al.The importance of myofiber type［J］.Food Microstructure，1984（3）：1-7

［9］ 張永輝，閻 萍，王 強，等.青海大通牦牛肌間脂肪酸組成分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（7）：2978-2980.

［10］ 冶成君.優(yōu)質(zhì)牦牛肉肉質(zhì)的綜合評價［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2004，34（4）：18-19.

［11］ 孫竹瓏，鐘光輝.九龍牦牛肌肉組織學(xué)特性研究（初報）［J］.西南民族學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，1990，16（3）：31-36.

［12］ Kiessling A，Storebakken T，Asgard T，et al.Changes in the structure and function of the epaxial muscle of rainbow trout in relation to ration and age I growth dynamics［J］.Aquaculture，1991（93）：335-356.

［13］ 王細文，仇玉福，陳意生.慢性缺氧大鼠右心房的超微病理變化及血漿ANF含量改變的實驗研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000（3）：44-47.

［14］ Costa L E，Boveris A，Koch O R，et al.Liver and heart mitochondria in rat submitted tochronic hypobaric hypoxia［J］.Am J Physiol Cell Physiol，1988，255（1）：C123-C129.

［15］ 孫小華，許豪文.模擬5000m海拔時不同暴露時間對大鼠肌肉結(jié)構(gòu)和功能的影響［J］.武漢體育學(xué)院學(xué)報，1999，33（2）：23-27.

［16］ 齊新章.高原鼢鼠和高原鼠兔心臟對低氧的適應(yīng)機制［D］.青海西寧：青海大學(xué)，2009：59.