張松林，劉 磊，張?zhí)?，馬永彪，王文秀，肖 娜，沈志強(qiáng)，＊

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.山東省綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；3.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊261041）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）于1987在美國首次發(fā)現(xiàn)，目前該病已在全世界范圍內(nèi)流行，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。在美國，每年因?yàn)镻RRS造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)6.6億美元［1］。該病的主要特征是母豬繁殖障礙，哺乳仔豬死亡率升高，各年齡段豬特別是哺乳和保育階段仔豬的呼吸道疾病以及生長和育肥豬的流感樣癥狀。在我國，自1996年首次分離到PRRSV以來，尤其2006年春季流行的高致病性PRRS給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。按照血清型和遺傳性差異，PRRSV可劃分為歐洲型（基因I型，代表株Lelystad virus，LV）和美洲型（基因Ⅱ型，代表株VR2332）。目前，根據(jù)世界各地分離株的基因變異程度，歐洲型和美洲型PRRSV又被劃分為幾個(gè)不同的系統(tǒng)進(jìn)化樹［4］。

PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus）成，其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長約15.1kb～15.5kb，直徑為50nm～65 nm，包括9個(gè)開放讀碼框（ORF1a，ORF1b，ORF2～7）。PRRSV基因組兩端為對RNA合成過程起調(diào)控作用的非編碼區(qū)，其中5＇端具有甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)和3′poly（A）尾［5-7］。ORF1a和 ORF1b約占全基因組的75%，通過核糖移碼機(jī)制，翻譯得到2個(gè)大的聚合蛋白pp1a和pp1ab。通過4種蛋白酶（位于Nsp1的PCPa、PCPβ，位于 Nsp2的CP，位于 Nsp4的SP），RNA依賴性RNA聚合酶（NSP9），解旋酶（NSP10），核酸內(nèi)切酶（NSP11）的作用，pp1a和pp1ab被切割產(chǎn)生14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural proteins，NSPs）［6-7］。迄今為止，除了復(fù)制、切割、聚合酶活性外，關(guān)于這些非結(jié)構(gòu)蛋白的其他功能還知之甚少。

歐洲型和美洲型PRRSV之間存在抗原性差異，二者結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸同源性為55%～79%。歐、美洲型毒株之間同源性O(shè)RF2為65%～67%、ORF3為61%～64%、ORF4為63%～66%、ORF5為61%～63%、ORF6為79%～81%、ORF7為67%。ORF6和ORF7基因序列在美洲型毒株內(nèi)和歐洲型PRRSV毒株內(nèi)相對保守，同源性達(dá)96%～100%。有學(xué)者還比較了10個(gè)美洲型毒株ORF2～ORF7序列，發(fā)現(xiàn)美洲型毒株間的核苷酸差異在2.5%～7.9%間，但與LV株比較差異則達(dá)35%，因?yàn)檫@些核苷酸差異零星分布于結(jié)構(gòu)基因中，因此無法解釋導(dǎo)致各PRRSV株明顯的遺傳性差異的機(jī)制［8］。

我國每年從歐洲國家進(jìn)口生豬，其中以英國和法國為最多，分別占進(jìn)口生豬總數(shù)的21%和18%左右［9］。然而，關(guān)于歐洲型PRRSV的報(bào)道卻很少。為調(diào)查我國歐洲型和美洲型PRRSV流行情況，同時(shí)減少2個(gè)亞型檢測的工作量，本文根據(jù)GenBank上已發(fā)表的美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV的基因組全序列，分別設(shè)計(jì)了2對能特異性擴(kuò)增歐洲型和美洲型PRRSV的引物，建立并優(yōu)化了可同時(shí)檢測歐洲型和美洲型PRRSV的雙重PCR方法。本方法的建立對這兩種病毒亞型的快速診斷有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細(xì)胞 Marc-145細(xì)胞，2株P(guān)RRSV分離株AME株和DY株均由山東省獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

1.1.2 工具酶和主要試劑 LATaqDNA聚合酶和Oligo d（T）18為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；MLV反轉(zhuǎn)錄酶，Trizol Reagent為invitrogen公司產(chǎn)品；其余的化學(xué)試劑均為進(jìn)口或者國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上的PRRSV歐洲型LV株（登錄號：M96262）和PRRSV美洲型VR2332株（登錄號：AY150564）的全基因序列，分別在各病毒基因組的保守區(qū)域用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)2對特異性擴(kuò)增引物（其中歐洲型為815bp，美洲型為329bp），并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 PCR引物名稱，序列及位置Table 1 The name，sequence and position of primers for PCR

1.2.2 病毒核酸的提取和PRRSV基因組cDNA的合成 參照Trizol說明書提取樣品（細(xì)胞，血清，組織）總RNA，溶解到50μL無RNA ddH2O中，置-70℃保存?zhèn)溆?。取PRRSV樣品10μL RNA作為模板，進(jìn)行cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄引物用Oligo d（T）18。反應(yīng)體系為：10μL RNA模板，2μL 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1μL Oligo d（T）18，1μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄 酶，2μL dNTP （10mmol／L），4.0μL 無RNA ddH2O。反應(yīng)條件為42℃60min，99℃5 min，4℃5min。

1.2.3 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增 用各自病毒的特異引物進(jìn)行單項(xiàng)PCR，在PCR反應(yīng)管中分別加入：病毒cDNA 5μL，上下游引物（10μmol／L）各1μL，dNTP（2.5mmol／L）4μL，10×LATaqDNA 聚合酶緩沖液2.5μL，LATaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5 μL，加ddH2O至25μL。歐洲型PRRSV PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。美洲型PRRSV PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.2.4 雙重PCR擴(kuò)增 將歐洲型和美洲型PRRSV的引物和模板進(jìn)行混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.2.5 PCR特異性檢測 在PCR反應(yīng)管中加入豬日本腦炎病毒（JEV）模板、豬瘟病毒（CSFV）模板、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）模板、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）模板、豬偽狂犬病毒（PRV）模板、豬細(xì)小病毒（PPV）模板、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）模板以及歐洲型和美洲型PRRSV模板，進(jìn)行PCR特異性檢測。PCR程序?yàn)椋?5℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。在此檢測試驗(yàn)中，除PRRSV外，其他每種病毒的陰性對照都添加了2對PRRSV引物，病毒擴(kuò)增采用特異性引物。

1.2.6 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 分別按照下列條件進(jìn)行多重PCR以確定各自的最佳條件：①退火溫度：選擇53.9、55.1、56.3、57.5、58.7℃進(jìn)行梯度PCR。②引物濃度：選擇25、12.5、6.25、2、1、0.5 μmol／L進(jìn)行反應(yīng)。③擴(kuò)增增強(qiáng)劑：甜菜堿和甘油分別按30、80、150g／L加入。

2 結(jié)果

2.1 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果

反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物各取5μL，在8g／L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。LV株擴(kuò)增出一條800 bp大小的條帶，VR2332株擴(kuò)增出一條300bp大小的條帶，大小與預(yù)期設(shè)計(jì)相符（圖1）。

2.2 雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果

將歐洲型和美洲型PRRSV的引物和模板進(jìn)行混合，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，2種PRRSV亞型均擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶（圖2）。

圖1 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of single PCR products

圖2 雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification results of duplex PCR products

2.3 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

以歐洲型和美洲型PRRSV引物均擴(kuò)增不出JEV、CSFV和PEDV等病毒條帶，而以各個(gè)檢測病毒特異引物均能得到特異性目的條帶（圖3）。說明本文的2對PRRSV特異性好，可以用于臨床檢測。

圖3 PCR特異性檢測結(jié)果Fig.3 The detection results of PCR specificity

2.4 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

本研究對影響PCR擴(kuò)增效果的退火溫度、引物濃度、Taq濃度以及PCR擴(kuò)增增強(qiáng)劑進(jìn)行了探索研究。在不同退火溫度擴(kuò)增試驗(yàn)中，53.9℃～58.7℃各個(gè)溫度均能擴(kuò)增出2個(gè)亞型的特異條帶，且各個(gè)溫度擴(kuò)增組均無非特異性擴(kuò)增，因此53.9℃～58.7℃5個(gè)退火溫度均可用于本研究的PCR反應(yīng)（圖4）。在不同退火溫度擴(kuò)增試驗(yàn)中，1μmol／L～25μmol／L引物濃度均可特異擴(kuò)增出2個(gè)亞型PRRSV產(chǎn)物，伴隨著引物濃度的增加，引物二聚體條帶逐漸增加。0.5μmol／L擴(kuò)增組只能擴(kuò)增出美洲型PRRSV產(chǎn)物，因此，本研究最佳引物濃度為1μmol／L（圖5）。在PCR擴(kuò)增增強(qiáng)劑試驗(yàn)中，加入30、80、150mL／L的甘油均無法擴(kuò)增出歐洲型產(chǎn)物（圖6），加入80g／L 和150g／L 的甜菜堿 均可PRRSV擴(kuò)增出歐洲型和美洲型PRRSV特異性條帶，而加入30g／L甜菜堿試驗(yàn)組，只能擴(kuò)增出美洲型PRRSV產(chǎn)物（圖7）。

3 討論

盡管全世界眾多的科學(xué)家和科研機(jī)構(gòu)投入大量的精力研究PRRSV，但PRRS防控仍然不理想。PRRSV就像人類免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）一樣，其防控和研發(fā)有效疫苗面臨巨大的挑戰(zhàn)。對于PRRSV檢測來說，由于病毒自身基因高度變異特性，研究人員通常選擇不同亞型均高度保守的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增。由于PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白M和N是所有不同亞型較保守基因，因此M和N蛋白基因被認(rèn)為是理想的PRRSV檢測候選基因［10-16］。

與以往文獻(xiàn)報(bào)道不同，本研究的引物設(shè)計(jì)選擇了PRRSV Nsp9和Nsp10部分區(qū)域。Nsp9和Nsp10-11是尼多病毒最保守蛋白［17］。Nsp9編碼RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），它由復(fù)制功能區(qū)及其上游未知功能區(qū)域組成。Nsp10具有解旋酶活性，包含有鋅指結(jié)構(gòu)（Zinc finger，ZF），同Nsp9一起組成動(dòng)脈炎病毒RNA合成的關(guān)鍵酶。ZF包含13個(gè)十分保守的半胱氨酸和組氨酸殘基，對于維持ATPase和解旋酶活性是必須的［18］。Nsp11具有內(nèi)切核糖核酸酶（endoribonuclease，NendoU）活性和抑制干擾素產(chǎn)生功能，并且在所有尼多病毒共有的 “自殺酶”［19］。

圖4 最佳退火溫度的測定結(jié)果Fig.4 The detecting results of optimal annealing temperature

圖5 不同引物濃度擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 The amplified results with different primer concentrations

圖6 不同甜菜堿濃度擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Different betaine concentration amplification results

圖7 不同甘油濃度擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Different glycerol concentration amplified results

本研究參考PRRSV歐洲型LV株和美洲型VR2332株的NSP9和NSP10部分區(qū)域設(shè)計(jì)了2對引物，試驗(yàn)結(jié)果表明，該引物對LV株和VR2332具有高度特異性。無論單項(xiàng)PCR還是雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果，除了目的條帶外，均無其它非特異性擴(kuò)增雜帶（圖1和圖2）。因此，本文所建立的方法適用于實(shí)驗(yàn)室快速檢測歐洲型和美洲型PRRSV。

影響多重PCR效果的因素很多，主要包括退火溫度、引物濃度、Taq濃度和 Mg2＋濃度等。此外，對于一些二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因需要使用擴(kuò)增增強(qiáng)劑。為了使雙重PCR具有更穩(wěn)定的擴(kuò)增效果，降低一些生物試劑的使用量，本研究對退火溫度等因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示本研究在經(jīng)典PCR反應(yīng)條件下可以完成擴(kuò)增，將引物濃度調(diào)整至1μmol／L并加入80g／L甜菜堿可提高反應(yīng)的特異性，并特異性增加擴(kuò)增產(chǎn)物量。

我國每年從歐洲國家進(jìn)口大量的生豬，但歐洲型PRRSV的相關(guān)檢測、功能基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)等研究卻很少報(bào)道。本研究建立的方法具有快速、簡便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)檢測歐洲型和美洲型PRRSV毒株。本方法的建立，對于跟蹤、監(jiān)測進(jìn)口生豬的PRRSV不同亞型的感染情況具有重要意義。

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