張 穎，魯 承，趙文婧，陳海迪，高 旭

（延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林延吉133000）

鵝細小病毒病是由鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的主要侵害4日齡～20日齡雛鵝的一種病毒性傳染病，該病病程短，傳染性強，病死率高，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴重的危害［1-3］。該病毒由我國學者方定一于1956年在江蘇揚州首次發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)VP3基因是GPV核衣殼的主要成分，約占總蛋白含量的80%，具有較高的保守性，能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，是GPV的主要保護性抗原［4-5］。本研究擬以本課題組前期分離的延邊株（YBLJ）鵝細小病毒為毒株，克隆VP3基因和構(gòu)建真核表達載體，并研究GPV的VP3基因在Vero細胞中表達情況，為進一步研制GPV的VP3基因核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌種 GPV（YBLJ株）為本實驗室從延邊某養(yǎng)鵝場發(fā)生鵝細小病毒病的病死鵝脾臟中分離得到。大腸埃希菌JM109、pcDNA3.1（＋）菌株由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ，以及ExTaq酶、DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；小鼠抗GPV VP3蛋白單抗為本試驗室制備；FITC標記的兔抗小鼠IgG二抗為Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)已克隆的鵝細小病毒 YBLJ株 VP3基因序列 （GenBank：JN836326）［6］，利用Loligo 6.0軟件設(shè)計合成了一對引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，擴增片段長度為1 605bp。序列如下：上游5′-ATAAGCTTGCCACCATGGCAGAGGGAGGAG-3′（HindⅢ）；下 游5′-CGGGCTCGAGTTACAGATTTTGAGTT-3′（XhoⅠ）。

1.2.2 PCR擴增及克隆 以提取的GPV基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應程序為：95℃5min；94℃40s，58℃45s，72℃1min 40s，進行30個循環(huán)；72℃10min。純化回收VP3基因片段，與克隆載體pMD-18T連接，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞。將PCR及酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.2.3 重組表達質(zhì)粒的pcDNA-VP3的構(gòu)建及鑒定 將鑒定正確的克隆質(zhì)粒pMD-VP3和pcDNA質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，回收VP3片段和pcDNA載體進行連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pcDNA-VP3。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進行鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 用雙無培養(yǎng)液對重組質(zhì)粒pcDNA-VP3和LipofectamineTM 2000進行稀釋后，通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染Vero細胞，具體方法參照說明書進行操作。

1.2.5 RT-PCR檢測 采用Trizol法提取細胞總RNA［7-8］，按照寶生物工程（大連）有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進行PCR擴增。

1.2.6 間接免疫熒光試驗（IFA）檢測 收集轉(zhuǎn)染的Vero細胞，在載玻片上包被后進行冷丙酮固定，以小鼠抗GPV的VP3蛋白單抗為一抗，熒光素標記的兔抗小鼠IgG為二抗，進行IFA檢測，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 VP3基因的克隆及真核表達載體的構(gòu)建

以提取的GPV基因組DNA作為模板進行PCR擴增，在約1 605bp處出現(xiàn)了與預期片段大小相符的特異性目的條帶（圖1）。對PCR鑒定為陽性的真核質(zhì)粒pcDNA-VP3進行酶切鑒定得到約5 428bp和1 605bp的2個片段（圖2），表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。同時測序結(jié)果也驗證了真核表達載體已成功構(gòu)建。

圖1 VP3基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of VP3gene

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmids by enzyme digestion

2.2 RT-PCR檢測

提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Vero細胞培養(yǎng)物總RNA，進行RT-PCR擴增，在約1 605bp處有一個明顯的目的條帶（圖3）。

2.3 IFA檢測結(jié)果

在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Vero細胞中出現(xiàn)綠色熒光，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的Vero細胞未出現(xiàn)綠色熒光（圖4），表明VP3基因在Vero細胞中獲得表達。

圖3 RT-PCR檢測結(jié)果Fig.3 Result of RT-PCR amplification

圖4 表達產(chǎn)物的IFA檢測結(jié)果 （200×）Fig.4 IFA detection result of gene expression in Vero cells（200×）

3 討論

細小病毒（Parvovirus）分為自主復制型細小病毒和依賴型細小病毒，鵝細小病毒（GPV）屬于自主復制型細小病毒，復制過程不需要輔助性病毒存在，病毒為無囊膜單鏈DNA病毒。GPV主要侵害4日齡～20日齡雛鵝，病毒可垂直傳播，種鵝是主要的傳染源，通過種蛋使雛鵝感染，由于雛鵝免疫系統(tǒng)不健全，導致感染雛鵝大批死亡，有的死亡率高達100%，因此鵝細小病毒病又名小鵝瘟，嚴重危害養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展［9-11］。目前，國內(nèi)外GPV疫苗以傳統(tǒng)疫苗為主，但其存在著滅活不徹底、毒力返強和散毒等缺點，致使GPV在鵝群中長期存在，無法凈化，而核酸疫苗避免了以上諸多缺點。因此，研制GPV核酸疫苗仍是當務之急。

在GPV的3種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2和VP3）中，衣殼蛋白VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白和病毒核衣殼的主要成分，暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激機體產(chǎn)生保護性中和抗體的重要抗原蛋白，所以VP3基因是研制 GPV 核 酸疫苗的首選基 因［1，5，12］。目前常用的真核表達載體有pVAX1、pcDNA3.1和pJW4304等，均含有CMV啟動子，能夠高水平的表達外源基因，其中pcDNA3.1質(zhì)粒較小，易被細胞攝取，有助于維持mRNA的穩(wěn)定性，利于在哺乳動物細胞中高水平表達重組蛋白。張建遠等［13］應用pcDNA載體構(gòu)建的SARS冠狀病毒核酸疫苗和豬圓環(huán)病毒核酸疫苗免疫動物后，結(jié)果顯示所構(gòu)建的核酸疫苗能誘導機體產(chǎn)生較好的免疫反應。因此，本試驗采用pcDNA作為真核表達載體，構(gòu)建了pcDNA-VP3真核表達載體。在轉(zhuǎn)染方面采用操作簡單易行、可靠的脂質(zhì)體介導法進行真核細胞轉(zhuǎn)染，通過LipofectamineTM 2000將真核表達質(zhì)粒pcDNA-VP3轉(zhuǎn)染至Vero細胞中，結(jié)果表明在外源啟動子的起始下，重組質(zhì)粒能夠在Vero細胞中穩(wěn)定表達VP3基因，經(jīng)IFA檢測證明表達的VP3蛋白具有反應活性，提示已成功構(gòu)建了GPV VP3基因的真核表達載體。本試驗的研究結(jié)果為進一步研究GPV VP3基因在雛鵝體內(nèi)的表達情況提供了理論依據(jù)，為研制GPV核酸疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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