王林纖， 戴 勇△， 文錦麗， 涂植光， 張 麗， 齊素文

(1深圳市人民醫(yī)院，暨南大學第二臨床醫(yī)學院臨床醫(yī)學研究中心，廣東 深圳 518020； 2重慶醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016)

定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)構(gòu)建系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜*

王林纖1， 戴 勇1△， 文錦麗1， 涂植光2， 張 麗1， 齊素文1

(1深圳市人民醫(yī)院，暨南大學第二臨床醫(yī)學院臨床醫(yī)學研究中心，廣東 深圳 518020；2重慶醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016)

目的應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人外周血單個核細胞中的“全組”蛋白進行鑒定和定量分析，獲得SLE的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜。方法利用基于四重相對和絕對定量的等量異位標簽結(jié)合多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析SLE穩(wěn)定期和活動期病人以及類風濕關(guān)節(jié)炎病人和健康人的外周血單個核細胞總蛋白，用肽質(zhì)量指紋譜經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)，并比較這些蛋白的表達差異。結(jié)果共鑒定了400多個蛋白質(zhì)。其中，與健康對照組相比，SLE穩(wěn)定組和SLE活動組共發(fā)現(xiàn)2倍以上表達差異的蛋白質(zhì)44個，上調(diào)的9個，下調(diào)的35個；與類風濕關(guān)節(jié)炎疾病組相比，SLE穩(wěn)定組和SLE活動組2倍以上表達差異的蛋白共有52個，上調(diào)的19個，下調(diào)的33個；SLE活動組與SLE穩(wěn)定組相比，表達上調(diào)和下調(diào)的蛋白分別為17個和13個。結(jié)論定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)可有效地用于人外周血單個核細胞蛋白鑒定和相對定量；采用該技術(shù)獲得了SLE病人外周血單個核細胞的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜；深入研究這些蛋白的分子機制將有助于進一步闡明SLE的發(fā)病機制，為SLE的診斷和治療提供新途徑。

定量蛋白質(zhì)組學； 紅斑狼瘡，系統(tǒng)性； 單個核細胞

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種累及全身多個系統(tǒng)、復發(fā)和緩解交替出現(xiàn)的自身免疫性疾病。該病的病程長，結(jié)果不可預知，更嚴重的是SLE可導致包括腎、肺、心臟、腦等多器官的病理損害，有約15%的患者在發(fā)病5年內(nèi)死亡或出現(xiàn)腎功能衰竭。自從糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑被用于治療SLE后，患者的預后雖有明顯改善，但總的來說該病治療現(xiàn)狀仍不容樂觀，因為糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑的應(yīng)用同時也從整體上抑制了機體的免疫功能，同時復發(fā)也是治療過程中面臨著的一個嚴峻問題。究其根本原因，還是我們還沒有把握住SLE發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對導致SLE免疫功能紊亂的源頭機制還不清楚。目前認為，SLE的發(fā)病機制涉及遺傳、T/B細胞調(diào)節(jié)性功能缺陷、感染、激素、環(huán)境因素等多種因素的復雜作用[1,2]。其中，淋巴細胞異常凋亡及活化、Th1和Th2調(diào)節(jié)失衡，淋巴細胞分泌功能及其免疫通路異常等在SLE的致病中發(fā)揮了非常重要的作用[3]。由于SLE臨床表現(xiàn)復雜，其早期和準確診斷仍然很難?，F(xiàn)有的實驗室診斷方法包括抗核抗體的檢查等無論是特異性還是敏感性都不能有效地滿足臨床需求，也沒有發(fā)現(xiàn)能較好地反應(yīng)SLE疾病活動情況的標志物來監(jiān)測SLE的疾病進程。 因此，有必要用創(chuàng)新的方法尋找和發(fā)現(xiàn)新的SLE疾病標志物或能代表SLE疾病活動情況的蛋白分子。

相對和絕對定量的等量異位標簽(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)是由Applied Biosystems公司新近研發(fā)的一種功能強大的體外多肽標記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素編碼的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，爾后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量。結(jié)合多維液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜分析，近幾年，iTRAQ技術(shù)已成為差異蛋白質(zhì)組學定量研究主要工具之一，被用于多種疾病標志物的發(fā)現(xiàn)及疾病進程和預后分析。研究證明，iTRAQ標記技術(shù)是研究細胞或組織不同生理狀態(tài)，或比較正常和病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)組異同的一種有效方式[4]。但是，目前國內(nèi)外尚無將iTRAQ技術(shù)用于人單個核細胞(主要成分為淋巴細胞)或SLE疾病蛋白組學的相關(guān)報道。鑒于淋巴細胞調(diào)節(jié)通路異常被認為廣泛地參與SLE的病理過程，我們用iTRAQ標記技術(shù)對SLE活動組和SLE穩(wěn)定組外周血單個核細胞的蛋白質(zhì)組學進行了分析比較，獲得SLE的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜，為進一步闡明SLE的發(fā)病機制提供新線索。

材 料 和 方 法

1材料

1.1試劑與設(shè)備 質(zhì)譜級超純水、乙腈(Merck)；三氟乙酸(TFA)、丙酮 (Sigma)；外周血單個核細胞分離液Lympholyte?-H (Cedarlane)；M-PER?蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)；三乙基碳酸氫銨、氯化鉀(Sigma)；質(zhì)譜級胰蛋白酶(Promega)；iTRAQ 4-plex 標記試劑及緩沖液(Applied Biosystems)；超高速低溫離心機、紫外分光光度儀(Eppendorf)；真空冷凍干燥機(Martin Christ)；Agilent 1100 series色譜分離系統(tǒng)(Agilent)；TempoTMLC MALDI 高效液相色譜儀、4800 Plus MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析儀(Applied Biosystems)。

1.2研究對象 所有病例均來自深圳市人民醫(yī)院。實驗共分為4組，即SLE穩(wěn)定組、SLE活動組、類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)疾病對照組和健康對照組。SLE的診斷依據(jù)1982美國ACR(American College of Rheumatology)修訂的診斷標準[5]，并按疾病活動性指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)[6]將SLE分為穩(wěn)定組(SLEDAI ≤ 8)和活動組(SLEDAI > 8)；RA的診斷符合1987年美國ARA(American Rheumatism Association)修訂的診斷標準[7]。SLE穩(wěn)定組女5例，男1例，平均年齡(33.67±9.24)歲；SLE活動組女5例，男1例，平均年齡(31.83±7.96)歲；RA組女5例，男1例，平均年齡(40.17±10.19)歲；健康對照組女5例，男1例，平均年齡(35.67±8.14)歲。各組資料除SLE相關(guān)指標外，其它指標差異無顯著(P>0.05)。

2方法

2.1樣本準備 靜脈采集空腹8 h以上肝素鋰抗凝全血約10 mL，用Lympholyte?-H分離液分離外周血單個核細胞，M-PER?Mammalian 蛋白抽提試劑抽提細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。所有步驟均按廠家提供的說明書進行。

2.2iTRAQ標記 按廠家說明書操作。每組各取100 μg蛋白，加入6倍體積，-20 ℃預冷的丙酮沉淀過夜，真空燥后逐步加入溶解緩沖液、變性劑和還原劑，混勻，60 ℃孵育1 h；加入半胱氨酸封閉劑，室溫孵育10 min；加入胰蛋白酶，37 ℃酶解過夜。酶解緩沖液為pH 8.5的0.5 mmol/L三乙基碳酸氫銨。然后進行iTRAQ標記：iTRAQ114-健康對照組，iTRAQ115-SLE穩(wěn)定組，iTRAQ116-SLE活動組，iTRAQ117-RA組。室溫反應(yīng)1 h后混合所有標記樣品，真空干燥。

2.3強陽離子交換 上述標記樣品用上樣緩沖液(10 mmol/L KH2PO4，25%乙腈，pH 3.0)稀釋10倍，上樣到強陽性離子交換預裝柱(35 mm×0.3 mm, 300 ?, 3.5μm，Zorbax Bio-SCX)，用Agilent 1100 series 進行自動梯度洗脫，流速設(shè)定為20 μL/min。先用0-20% 緩沖液B(10 mmol/L KH2PO4，1 mol/L KCl，25%乙腈，pH 3.0)洗脫40 min，每5 min收集1次各鹽濃度洗脫下的多肽；再用20%-50% 緩沖液B繼續(xù)洗脫20 min，每10 min收集1次洗脫液。

2.4反相液相色譜分離 洗脫下來各多肽組分經(jīng)TempoTMLC MALDI在線分離系統(tǒng)進行自動上樣、反相洗脫和點靶。C18反相柱規(guī)格為150 mm× 0.2 mm，200 ?，3μm (Michrom Bioresources)。流動相B由98% 乙腈和0.1% TFA組成，流速設(shè)定為2μL/min，洗脫時間為100 min，每塊MALDI靶板可點樣380個點左右。洗脫梯度設(shè)定如下：0-5 min，流動相B為5%，5-65 min，流動相B從5%線性增至40%，65-75 min，流動相B從40%線性增至60%，75-80 min，流動相B從60%線性增至95%，80-90 min，流動相B為95%，90-95 min，流動相B從95%線性減至5%，至100 min停止洗脫。

2.5質(zhì)譜檢測和相對定量分析 采用4800 Plus MALDI TOF/TOF蛋白質(zhì)分析儀進行多肽的串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和相對定量分析。一級質(zhì)譜激光激發(fā)800次，在陽離子模式下用反射模式進行檢測，選擇信噪比大于40的母離子做二級質(zhì)譜(MS/MS)分析，每個樣品點上最多選擇40個母離子。二級MS/MS激光激發(fā)1 600次，碰撞能量1 kV，碰撞誘導解離(collision-induced dissociation，CID)小室內(nèi)的氮氣壓力維持在2.0×10-4Pa。采用Applied Biosystems公司提供的ProteinPilotTM3.0軟件進行報告離子的相對定量分析，選用IPI (International Protein Index) human V 3.62 蛋白數(shù)據(jù)庫進行蛋白的檢索和鑒定，同時用質(zhì)荷比(m/z) 114、115、116、117報告離子的峰面積積分進行相對定量分析，以m/z 114為對照，按115∶114、116∶114、117∶114的比值，選擇比值≥2或≤0.05的結(jié)果進行報告。蛋白置信度設(shè)定為>95%或ProtScore>1.3。

結(jié) 果

以蛋白置信度>95%或ProtScore>1.3為限，共鑒定了4 056個肽段，452個非冗余蛋白。經(jīng)ProteinPilotTM3.0軟件分析，獲得SLE疾病的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜。

1SLE穩(wěn)定組與健康對照組的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜

與健康對照組相比，SLE穩(wěn)定組有3個蛋白表達顯著上調(diào)，6個蛋白表達顯著下調(diào),見表1。

2SLE活動組與健康對照組的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜

與健康對照組相比，SLE活動組有20個蛋白表達顯著上調(diào)，15個蛋白表達顯著下調(diào)，見表2。

3SLE穩(wěn)定組與RA對照組的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜

與RA對照組相比，SLE穩(wěn)定組有11個蛋白表達顯著上調(diào)，8個蛋白表達顯著下調(diào)，見表3。

4SLE活動組與RA對照組的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜

與RA對照組相比，SLE活動組有13個蛋白表達顯著上調(diào)，20個蛋白表達顯著下調(diào)，見表4。

5SLE活動組與SLE穩(wěn)定組的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜

與SLE穩(wěn)定組相比，SLE活動組有17個蛋白表達顯著上調(diào)，13個蛋白表達顯著下調(diào)，見表5。

表1 SLE穩(wěn)定組與健康對照組相比有顯著表達差異的蛋白質(zhì)

表2 SLE活動組與健康對照組相比有顯著表達差異的蛋白質(zhì)

表3 SLE穩(wěn)定組與RA對照組相比有顯著表達差異的蛋白質(zhì)

表4 SLE活動組與RA對照組相比有顯著表達差異的蛋白質(zhì)

表5 SLE活動組與SLE穩(wěn)定組相比有顯著表達差異的蛋白質(zhì)

在上述126個出現(xiàn)差異表達的蛋白中，除去39個跨組差異表達的“交疊”蛋白，共有不重復差異表達蛋白67個。其中，某些蛋白，如histone H2A type 1、myeloblastin(圖1)等在SLE活動組中的表達比其它各組都高；另一些蛋白在SLE活動組中的表達比其它各組都低，如：myosin regulatory light polypeptide 9, nucleolar protein 5A等。與RA組或健康對照組相比，AF4/FMR2 family member 1等在SLE穩(wěn)定組和SLE活動組均出現(xiàn)高表達，而glutathione S-transferase kappa 1 isoform c(圖2)則相反；與健康對照組相比，cDNA FLJ55107, highly similar to cell division control protein 42 homolog在SLE穩(wěn)定組和SLE活動組都表達上調(diào)，但是與RA組相比，該蛋白表達并無顯著差異。與其它各組比，structural maintenance of chromosomes protein 3 在SLE穩(wěn)定組的表達水平顯著降低。

Figure 1. Myeloblastin sequencing and quantification using iTRAQ. A representative MALDI-TOF-MS with fragmented b-ions and y-ions of peptide PHNICTFVPR belonging to myeloblastin. The labeled ion assignments are as follows: healthy control-iTRAQ 114; stable SLE-iTRAQ 115; active SLE iTRAQ-116; RA-iTRAQ 117.

圖1序列為PHNICTFVPR的myeloblastin特異性多肽的鑒定及iTRAQ報告離子相對定量的二級質(zhì)譜圖

Figure 2. Glutathione S-transferase kappa 1 isoform c sequencing and quantification using iTRAQ. A representative MALDI-TOF-MS with fragmented b-ions and y-ions of peptide HHLQIPIHFPK belonging to glutathione S-transferase. The labeled ion assignments are as follows: healthy control-iTRAQ 114; stable SLE-iTRAQ 115; active SLE-iTRAQ-116; RA-iTRAQ 117.

圖2序列為HHLQIPIHFPK的glutathioneS-transferasekappa1isoformc特異性多肽的鑒定及iTRAQ報告離子相對定量的二級質(zhì)譜圖

討 論

近年來, 為滿足定量蛋白質(zhì)組學研究的需要,基于高度敏感性和精確性的串聯(lián)質(zhì)譜分析進行蛋白質(zhì)定量的相關(guān)標記技術(shù)發(fā)展迅速，iTRAQ標記串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是這些新進展中的一大主力[8]。本研究中，我們采用iTRAQ相關(guān)技術(shù)對SLE病人外周血單個核細胞總蛋白進行鑒定和比較蛋白組學相對定量分析，共鑒定了452個蛋白，其中有67個蛋白在不同組間出現(xiàn)顯著差異表達，表明將iTRAQ標記串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于SLE病人外周血單個核細胞的比較蛋白組學分析是一種行之有效的方法。

與健康對照組相比，SLE活動組出現(xiàn)差異表達的蛋白為35個，遠遠多于SLE穩(wěn)定組出現(xiàn)差異表達的蛋白9個，說明SLE疾病活動期炎性活動加劇，炎性損害加強，有更多的蛋白分子參與淋巴細胞異常調(diào)節(jié)和SLE的疾病活動過程。

與RA相比，SLE穩(wěn)定組和SLE活動組分別有11、13個蛋白表達顯著上調(diào)，有8、20個蛋白表達顯著下調(diào)。對這些蛋白進行進一步的驗證分析和研究將有助于闡明SLE和RA在發(fā)病機制上的異同，為SLE的鑒別診斷與個性化治療打下基礎(chǔ)。

以往的研究表明，以血清或組織為樣本的iTRAQ標記技術(shù)在疾病活動性標志物的發(fā)現(xiàn)和對疾病的預后評價中具有積極作用[4]。依據(jù)SLE疾病的嚴重程度而采取不同的治療方案在臨床上非常重要，但是目前臨床上還沒有可靠的可用于SLE疾病活動性分析的生物標志物。我們用iTRAQ標記技術(shù)對SLE活動組和SLE穩(wěn)定組外周血單個核細胞進行相對定量分析，共鑒定了17個在SLE活動組中表達顯著上調(diào)的蛋白和13個表達顯著下調(diào)的蛋白。這些階段特異蛋白可能參與SLE疾病的緩解和復發(fā)過程，有望作為SLE的疾病活動性指標，評估SLE疾病的嚴重性。

本次比較蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)了多個在SLE中差異表達的蛋白，其中有些蛋白分子已被證明參與SLE的潛在致病過程，如抵抗素(resistin)、S100蛋白家族等。Almehed等[9]研究發(fā)現(xiàn)抵抗素與SLE病人的全身性炎癥、腎臟病變及骨丟失等顯著相關(guān)。在本研究中，我們檢測到抵抗素在SLE穩(wěn)定組的表達并無顯著改變，但在SLE活動組出現(xiàn)高表達，提示抵抗素作為一種促炎癥因子，可促進SLE的復發(fā)。S100蛋白家族是鈣結(jié)合蛋白家族成員，可結(jié)合toll樣受體4(TLR4)。越來越多的證據(jù)表明它們是一類新的促炎蛋白(pro-inflammatory proteins)，在關(guān)節(jié)炎疾病的炎性過程中具有多向性[10]。Soyfoo等[11]發(fā)現(xiàn)SLE患者血清中S100 A8/A9的濃度升高，且升高幅度與SLE的疾病活動指數(shù)相關(guān)。Yang等[12]報道神經(jīng)精神性狼瘡患者血清和腦脊液中S100 B的濃度升高。值得注意的是，我們檢測到S100 P和S100 A12蛋白的表達在SLE活動組中顯著增加，而S100 A8、S100 A9和S100 A12的含量在SLE穩(wěn)定組則顯著降低，提示S100 P和S100 A12可能與SLE疾病活動的嚴重程度相關(guān)，而S100 A8、S100 A9和S100 A12則可能發(fā)揮協(xié)同抑制作用，參與SLE的炎癥修復并維持SLE的緩解過程。有些在SLE中出現(xiàn)顯著差異表達的蛋白，如BASP 1(brain acid soluble protein 1)和Ras相關(guān)C3肉毒梭菌毒素底物蛋白3等，已被證實與其它疾病的凋亡通路相關(guān)[13，14]，但它們在SLE疾病發(fā)展進程中的作用尚不清楚。

本研究首次運用iTRAQ多重標記技術(shù)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析，在“整體”蛋白組范圍內(nèi)對SLE患者的外周血單個核細胞的“全組”蛋白進行鑒定，從整體上建立了SLE疾病蛋白組數(shù)據(jù)庫。同時，通過對這些蛋白質(zhì)進行比較和相對定量分析，初步篩選在SLE中出現(xiàn)差異表達的蛋白分子，獲得了有關(guān)SLE疾病和SLE階段特異性的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜和相對定量分析結(jié)果，為進一步深入研究SLE的發(fā)病機制提供了新的依據(jù)。由于篇幅所限，在此不對篩選出來的蛋白逐一討論。今后的工作將著重于對篩選出的某些有價值的蛋白分子進行大樣本的驗證試驗和功能研究，為SLE的臨床診斷和治療提供新途徑。

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Differentialexpressionprofilingofproteomeforsystemiclupuserythematosuswithquantitativeproteomictechnique

WANG Lin-qian1, DAI Yong1, WEN Jin-li1, TU Zhi-guang2, ZHANG Li1, QI Su-wen1

(1ClinicalResearchCenteroftheSecondClinicalMedicalCollege,JinanUniversity,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China;2KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalDiagnostics,MinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:daiyong22@yahoo.com.cn)

AIM: To identify and quantify the total proteins in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of systemic lupus erythematosus (SLE) patients with quantitative proteomic technique, and to establish a differential expression profile of proteome for SLE.METHODSFour-plex isobaric tags for relative and absolute quantification coupled with multiple chromatographic fractionation and tandem mass spectrometry were used to analyze the total proteins in PBMC from healthy controls and the patients of stable SLE, active SLE and rheumatoid arthritis. The proteins were identified by database searching with peptide mass fingerprinting. The differential expression of the proteins was compared.RESULTSMore than 400 proteins were identified. Compared with healthy controls, 44 proteins were discovered to be significantly expressed by more than 2 folds in stable SLE and active SLE, among which 9 proteins were up-regulated and 35 proteins were down-regulated. Compared with rheumatoid arthritis group, 52 proteins displayed 2 or more folds of changes in stable SLE and active SLE, including 19 up-regulated proteins and 33 down-regulated ones. The up-and down-regulated proteins between active SLE and stable SLE were 17 and 13, respectively.CONCLUSIONQuantitative proteomic technique is efficiently applicable for protein identification and relative quantitation in human peripheral blood mononuclear cells. Determination of the differentially expressed proteomic profile of SLE is helpful for better understanding the pathogenesis of SLE and developing new strategies for diagnosis and treatment of SLE.

Quantitative proteomics; Lupus erythematosus, systemic; Mononuclear cells

R34

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.030

1000-4718(2011)01-0153-08

2010-07-01

2010-09-25

深圳市科技計劃重點資助項目(No.201001001)

△通訊作者 Tel：0755-25626750； E-mail：daiyong22@yahoo.com.cn