汪 泱， 張立行， 王共先， 謝 安， 婁遠(yuǎn)蕾， 阮瓊芳， 崔蘇萍， 楊 陽(yáng)

(南昌大學(xué)泌尿外科研究所, 江西 南昌 330006)

后腎細(xì)胞微環(huán)境誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向腎系細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究*

汪 泱△， 張立行， 王共先， 謝 安， 婁遠(yuǎn)蕾， 阮瓊芳， 崔蘇萍， 楊 陽(yáng)

(南昌大學(xué)泌尿外科研究所, 江西 南昌 330006)

目的探討胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(ESCs)分化為腎系細(xì)胞的作用。方法小鼠D3系胚胎干細(xì)胞通過(guò)懸滴法制備擬胚體(EBs)，將EBs細(xì)胞與取自孕12.5 d小鼠胚胎的后腎細(xì)胞通過(guò)間接共培養(yǎng)以誘導(dǎo)其分化，即為共培養(yǎng)誘導(dǎo)組，設(shè)EBs細(xì)胞自然分化為對(duì)照組；采用免疫熒光染色法檢測(cè)共培養(yǎng)第3、5、7 d后的EBs細(xì)胞Pax2、WT-1蛋白表達(dá)情況，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)3 d后的EBs細(xì)胞Pax2、WT-1、Lim1、Sall1、Emx2、GDNF、Wnt4、BMP7、Nephl、Nephrin、KSP和CD24 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果EBs細(xì)胞在誘導(dǎo)的第3 d即出現(xiàn)了全部腎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，其中共培養(yǎng)組Pax2、WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、Nephrin、KSP和CD24的表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組；免疫熒光結(jié)果顯示在誘導(dǎo)3 d后的EBs細(xì)胞中可觀察到Pax2陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在共培養(yǎng)第5、7 d增多；誘導(dǎo)5 d后可觀察到WT-1陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)照組未見(jiàn)Pax2或WT-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。結(jié)論后腎細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)ESCs分化為腎系細(xì)胞。

胚胎干細(xì)胞； 后腎細(xì)胞； 腎系細(xì)胞

急性腎衰竭的主要病因是各種原因?qū)е碌募毙阅I小管損傷，其轉(zhuǎn)歸依賴于腎內(nèi)存留的正常腎細(xì)胞數(shù)或具有修復(fù)作用的成體腎干細(xì)胞數(shù)目。目前，研究者致力研究修復(fù)損傷腎臟的方向之一是利用干細(xì)胞補(bǔ)充受損的腎細(xì)胞，其可能細(xì)胞來(lái)源包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)和自體的各種成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞的多向分化能力有限，而ESCs可分化為成體器官內(nèi)不同胚層的所有細(xì)胞，顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。腎臟是由多種細(xì)胞組成的復(fù)雜器官，研究ESCs向腎臟細(xì)胞定向分化可為腎損傷的修復(fù)再生提供種子細(xì)胞的新來(lái)源。本研究擬將小鼠ESCs形成的擬胚體(embryoid bodies, EBs)細(xì)胞與分離自E12.5 d胎鼠的后腎細(xì)胞間接接觸共培養(yǎng)，體外模擬胚胎腎臟發(fā)育微環(huán)境，觀察ESCs向腎臟細(xì)胞定向分化狀況，為進(jìn)一步建立ESCs向腎臟細(xì)胞定向分化的技術(shù)及研究ESCs分化為腎細(xì)胞的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞株 小鼠D3胚胎干細(xì)胞株(ES-D3)購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，小鼠后腎細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)均提取自昆明小鼠孕12.5 d(E12.5 d，觀察到陰道栓計(jì)孕0.5 d)胎鼠。昆明小鼠購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部。

1.2主要試劑和儀器 H-DMEM、0.05% EDTA/胰蛋白酶、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺均購(gòu)自Gibco。胎牛血清購(gòu)自Hyclone。2-巰基乙醇購(gòu)自Merk。絲裂霉素C購(gòu)自Roche。兔抗小鼠WT-1抗體購(gòu)自Neomarkers。兔抗小鼠Pax2抗體購(gòu)自Abcam。羅丹明標(biāo)記的?？雇肐gG購(gòu)自Chemicon。倒置相差熒光顯微鏡(IX71)和體視顯微鏡均為Olympus產(chǎn)品。

2方法

2.1ES-D3細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)EBs形成 將ES-D3細(xì)胞單細(xì)胞懸液添加到預(yù)先用絲裂霉素C處理過(guò)的MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞上，ESCs培養(yǎng)液包含H-DMEM、20% 胎牛血清、0.1 mmol/L 2-巰基乙醇、0.1 mmol/L 非必需氨基酸和2 mmol/L L-谷氨酰胺，細(xì)胞放于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵箱(Thermo)培養(yǎng)。制備EBs時(shí)，將脫離MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞的ES-D3細(xì)胞制備為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為約800-1 000 cells/30 μL，通過(guò)懸滴法培養(yǎng)制作EBs，在懸滴法培養(yǎng)的第3 d觀察并收集EBs，所用培養(yǎng)液為ESCs培養(yǎng)液。

2.2小鼠胚胎腎細(xì)胞的制備 取E12.5 d的孕鼠，無(wú)菌條件下打開(kāi)腹腔，取出胎鼠，在體視顯微鏡下分離后腎。后腎提取方法參照文獻(xiàn)[2]。即取E 12.5d胎鼠放置在30 mm塑料培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌眼科鑷子打開(kāi)胎鼠腹腔，體視顯微鏡下在胎鼠神經(jīng)管兩側(cè)胎鼠后肢芽水平面附近找到小鼠后腎，取出胎鼠后腎置入培養(yǎng)皿中。將取出的后腎組織用生理鹽水清洗2遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊后以0.05% EDTA/胰蛋白酶消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×108cells/L，種植到12孔Transwells(Costar)的插入式小皿中，細(xì)胞培養(yǎng)液為ESCs培養(yǎng)液。

2.3EBs細(xì)胞與胚胎后腎細(xì)胞間接接觸共培養(yǎng) 將懸滴法制備的EBs加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入的EBs為10-20個(gè)。共培養(yǎng)組：采用Transwells進(jìn)行間接接觸共培養(yǎng)，即將后腎細(xì)胞接種培養(yǎng)于Transwells的插入小皿中，EBs細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板的小孔中，2種細(xì)胞進(jìn)行間接接觸共培養(yǎng)，細(xì)胞分泌的因子可通過(guò)插入小皿的半透膜相互交換，但細(xì)胞間沒(méi)有直接接觸；自然分化對(duì)照組：于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)EBs細(xì)胞。每天半量換液，共培養(yǎng)3 d后，每天全量換液，培養(yǎng)液為ESCs培養(yǎng)液。

2.4RT-PCR法檢測(cè)EBs細(xì)胞腎臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá) 在共培養(yǎng)第3 d，按Trizol試劑盒說(shuō)明(Invitrogen)分別提取共培養(yǎng)組、對(duì)照組和E 12.5 d后腎組織的總RNA。按照RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)(Fermentas)兩步法逆轉(zhuǎn)錄總RNA。PCR反應(yīng)引物均由上海生物工程公司合成，引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)參數(shù)分別是：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，58-67 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。

表1 引物序列和退火條件

2.5間接免疫熒光染色法檢測(cè)Pax2、WT-1蛋白的表達(dá) 在共培養(yǎng)第3、5、7 d按照間接免疫熒光法，分別檢測(cè)共培養(yǎng)組和對(duì)照組EBs細(xì)胞Pax2、WT-1蛋白表達(dá)情況，即將EBs細(xì)胞用PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定20 min，加入1%牛血清白蛋白(Roche)封閉20 min，再分別滴加兔抗小鼠Pax2、WT-1抗體，4 ℃飽和濕度孵育過(guò)夜，PBS充分洗滌后滴加羅丹明標(biāo)記的?？雇肐gG，37 ℃孵育1 h，清洗后加入50 mg/L 4, 6-二乙酰基- 2-苯基吲哚(DAPI, Sigma) 襯染5 min。PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察并記錄拍照。

結(jié) 果

1細(xì)胞形態(tài)變化

生長(zhǎng)在MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞上的ES-D3細(xì)胞形成相互分離的圓形或橢圓形細(xì)胞集落，細(xì)胞集落邊緣清楚,見(jiàn)圖1A。ES-D3細(xì)胞通過(guò)懸滴法制備的EBs呈圓球狀懸浮于ESCs培養(yǎng)液中，細(xì)胞透亮活性較好，見(jiàn)圖1B。單獨(dú)分離培養(yǎng)的后腎細(xì)胞大多呈現(xiàn)成體腎小管細(xì)胞樣的鋪路石樣細(xì)胞集落，見(jiàn)圖1C。EBs細(xì)胞在共培養(yǎng)的第1 d即貼壁，第2 d即可觀察到EBs周?chē)猩倭考?xì)胞爬出，隨著培養(yǎng)天數(shù)延長(zhǎng)爬出細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為梭形、多角形、圓形或不規(guī)則形等，見(jiàn)圖1D。

Figure 1. Morphology of mouse embryonic stem cells on MEF feeder cells(A), embryoid body(B), primary culture of mouse E12.5 d metanephric cells(C) and EBs cells co-cultured with metanephric cells for 3 d(D).Bar=100 μm.

圖1小鼠胚胎干細(xì)胞、擬胚體、原代培養(yǎng)的胎腎細(xì)胞和3d共培養(yǎng)后的擬胚體細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2后腎細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)EBs細(xì)胞表達(dá)腎臟發(fā)育相關(guān)基因

與E12.5 d后腎細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后的EBs細(xì)胞，均表達(dá)所檢測(cè)的12種腎臟發(fā)育相關(guān)基因，其中WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、KSP和CD24 mRNA的表達(dá)明顯強(qiáng)于自然分化對(duì)照組，Pax2和Nephrin mRNA的表達(dá)亦強(qiáng)于自然分化對(duì)照組，但無(wú)顯著差異，自然分化對(duì)照組Lim1 mRNA的表達(dá)較強(qiáng)，Wnt4、Sall1、BMP7 mRNA的表達(dá)則在2組間相差不大，見(jiàn)圖2。

3后腎細(xì)胞微環(huán)境促進(jìn)EBs細(xì)胞表達(dá)Pax2和WT-1蛋白

與后腎細(xì)胞共培養(yǎng)的第3 d，即可見(jiàn)少數(shù)EBs細(xì)胞表達(dá)Pax2，而未見(jiàn)WT-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞；與后腎細(xì)胞共培養(yǎng)的第5 d可見(jiàn)Pax2陽(yáng)性細(xì)胞增多，亦見(jiàn)部分WT-1陽(yáng)性細(xì)胞；隨著共培養(yǎng)天數(shù)的延長(zhǎng)，Pax2和WT-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多并成簇分布，且在Pax2陽(yáng)性細(xì)胞中，有部分細(xì)胞呈現(xiàn)“指環(huán)”樣排列，見(jiàn)圖3。在自然分化對(duì)照組EBs中，未見(jiàn)Pax2或WT1陽(yáng)性細(xì)胞。表明后腎細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)EBs細(xì)胞表達(dá)Pax2和WT-1。

Figure 2. mRNA expression of the genes involved in kidney development in EBs cells(RT-PCR). A: 1: EBs cells co-cultured with metanephric cells for 3 d; 2: EBs cells natural differentiated for 3 d; 3: primary cultured E12.5 d metanephric cells. B: relative expression level.*P<0.05,△P<0.01vsEBs cells natural differentiated group.

圖2EBs細(xì)胞腎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

Figure 3. Pax2 and WT-1 positive cells in EBs cells. A-C: Pax2 positive cells emerged in EBs cells after 3 d co-culture(×200); J-L: WT-1 positive cells emerged in EBs cells after 5 d co-culture(×200); G-I(×200), M-O(×400) and P-R(×200): Pax2 and WT-1 positive cells number increased in EBs cells after 5 or 7 d co-culture. S-X: no Pax2 or WT-1 positive cells showed up in control groups.

圖3EBs細(xì)胞Pax2和WT-1的表達(dá)

討 論

由于腎臟組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有關(guān)ESCs向腎臟細(xì)胞分化的研究起步相對(duì)較晚。研究報(bào)道ESCs可向腎臟細(xì)胞分化，但調(diào)控ESCs向各種腎臟分化的關(guān)鍵因素及調(diào)控途徑尚不清楚[1-3]。胚胎干細(xì)胞的定向分化與其所處的微環(huán)境有關(guān)，通過(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)或提取細(xì)胞培養(yǎng)液的方法模擬發(fā)育所需微環(huán)境，研究者已經(jīng)成功將ESCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[4]、心肌細(xì)胞[5]、造血干細(xì)胞[6]等。哺乳動(dòng)物成體腎臟發(fā)育來(lái)自后腎，后腎包括后腎間充質(zhì)和輸尿管芽?jī)刹糠?，二者相互誘導(dǎo)最終形成成體腎，因此胚胎后腎細(xì)胞可能具有誘導(dǎo)ESCs分化成為腎臟細(xì)胞的能力。本研究將ESCs形成的EBs細(xì)胞與E12.5 d的后腎細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，體外模擬腎臟發(fā)育微環(huán)境，探討胚胎腎發(fā)育微環(huán)境定向誘導(dǎo)ESCs向腎細(xì)胞分化的作用，為進(jìn)一步研究ESCs向腎臟細(xì)胞分化的機(jī)制及建立高效誘導(dǎo)ESCs向腎臟細(xì)胞定向分化的方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了12種腎臟發(fā)育相關(guān)基因，其中Pax2、Lim1、Sall1和WT-1基因是在后腎發(fā)育早期即后腎胚芽開(kāi)始出現(xiàn)時(shí)的作用基因；后腎發(fā)育中期一般指從輸尿管芽長(zhǎng)入后腎間充質(zhì)區(qū)，到二者相互誘導(dǎo)發(fā)生comma-和S-形形變的過(guò)程，GDNF、Emx2、Wnt4和BMP-7基因在此期間發(fā)揮了重要作用；而Nephl、Nehprin和KSP基因主要作用于后腎發(fā)育晚期，三者也在成熟腎臟小管上皮細(xì)胞上表達(dá)。此外，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了腎臟祖細(xì)胞標(biāo)志物CD24 mRNA的表達(dá)變化[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與后腎細(xì)胞共培養(yǎng)后的ESCs表達(dá)所檢測(cè)的與腎臟發(fā)育相關(guān)的12種基因，其中Pax2、WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、Nephrin、KSP和CD24 mRNA的表達(dá)強(qiáng)于自然分化對(duì)照組，說(shuō)明胚胎后腎微環(huán)境可促進(jìn)ESCs表達(dá)腎臟發(fā)育相關(guān)基因。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與后腎細(xì)胞共培養(yǎng)后的ESCs表達(dá)腎臟細(xì)胞標(biāo)志蛋白Pax2和 WT-1，且部分Pax2陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)“指環(huán)”樣排列，而自然分化對(duì)照組未見(jiàn)Pax2或WT1陽(yáng)性細(xì)胞。表明胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)ESCs向腎臟細(xì)胞分化。本研究結(jié)果顯示ESCs在自然分化條件下亦表達(dá)腎臟發(fā)育相關(guān)基因，與Kramer等[8]的報(bào)道類似，說(shuō)明ESCs形成EBs過(guò)程中已具備向內(nèi)胚層細(xì)胞分化的潛能。進(jìn)一步篩選胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境中促進(jìn)ESCs向腎臟細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子并深入探討其作用途徑，對(duì)于將來(lái)精確調(diào)控ESCs向腎臟各種細(xì)胞的分化具有重要意義。

[1] Yamamoto M, Cui L, Johkura K, et al. Branching ducts similar to mesonephric ducts or ureteric buds in teratomas originating from mouse embryonic stem cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2006, 290(1): F52-F60.

[2] Kim D, Dressler GR. Nephrogenic factors promote differentiation of mouse embryonic stem cells into renal epithelia[J]. J Am Soc Nephrol, 2005, 16(12): 3527-3534.

[3] Kobayashi T, Tanaka H, Kuwana H，et al. Wnt4-transformed mouse embryonic stem cells differentiate into renal tubular cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2005, 336(2): 585-595.

[4] 周玉峰，方 峰，付勁蓉,等. 星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2006，22(12):2407-2410.

[5] Mummery C, Ward-van Oostwaard D, et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells[J]. Circulation, 2003, 107(21):2733-2740.

[6] 張緒超，陳惠芹，黃紹良,等. 含人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系定向誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為造血干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2007，23(9):1747-1751.

[7] Challen GA, Bertoncello I, Deane JA, et al. Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity[J]. J Am Soc Nephrol, 2006,17(7): 1896-1912.

[8] Kramer J, Steinhoff J, Klinger M, et al. Cells differentiated from mouse embryonic stem cells via embryoid bodies express renal marker molecules[J]. Differentiation, 2006,74(2-3): 91-104.

Metanephriccellmicroenvironmentinducesembryonicstemcellstodifferentiatetowardrenalcells

WANG Yang, ZHANG Li-xing, WANG Gong-xian, XIE An, LOU Yuan-lei, RUAN Qiong-fang, CUI Su-ping, YANG Yang

(InstituteofUrology,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wangy63cn@sina.com)

AIM: To explore the effects of metanephric cell microenvironment on inducing embryonic stem cells (ESCs) to differentiate toward renal cells.METHODSEmbryoid bodies (EBs) of D3 mouse embryonic stem cells were prepared by hanging drop culture, and the EBs were co-cultured indirectly with metanephric cells derived from E12.5 d mouse embryo. The EBs cell with spontaneous differentiation was used as the control. The proteins of Pax2 and WT-1 were analyzed by immunofluorescence assay. The mRNA expression of Pax2, WT-1, Lim1, Sall1, Emx2, GDNF, Wnt4, BMP7, Nephl, Nephrin, KSP and CD24 genes was detected by RT- PCR.RESULTSThe genes related to kidney development were expressed in the EBs cells after co-culture on day 3, and the mRNA expression of Pax2, WT-1, Emx2, GDNF, Nephl, Nephrin, KSP and CD24 was stronger than those in control group. Pax2 positive cells were found on day 3 in the co-cultured EBs cells, and the positive cells increased on day 5 and day 7. WT-1 protein positive cells were found in the co-cultured EBs cells on day 5. No Pax2 or WT-1 positive cell was observed in control group.CONCLUSIONMetanephric cell microenvironment promotes ESCs differentiation toward renal cells.

Embryonic stem cells; Metanephric cells; Renal cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.025

1000-4718(2011)01-0129-05

2010-07-28

2010-10-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30960385)；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2007GZY1470)

△通訊作者 Tel：0791-8692527； E-mail： wangy63cn@sina.com