紀(jì)朋艷，羅 速，姜艷霞

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，吉林 132013；2.北華大學(xué)，吉林 132013）

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草等，與名貴中藥冬蟲夏草為同屬真菌植物?！度珖胁菟巺R編》記載:“蛹蟲草（北蟲草）的子實(shí)體及蟲體也可作為冬蟲夏草入藥”［1］。由于冬蟲夏草在自然條件下不能長期保存，加之近年來環(huán)境條件日益受到破壞和無限的人工采集，蟲草資源越來越貧乏。而目前人工栽培蛹蟲草已獲成功［2－5］，因此，對其有效成分的研究、開發(fā)具有更深的意義。國內(nèi)外關(guān)于蛹蟲草提取物（RW）對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及機(jī)制鮮有報道。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)初步探討RW對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW111C的作用，為其作為一種抗癌藥物或防癌保健藥應(yīng)用于臨床提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW111C購自吉林省腫瘤研究所。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.1.2 藥物與試劑 RW（由北華大學(xué)崔新穎教授所贈）用無菌二甲基亞砜（DMSO）助溶，其中DMSO的濃度小于0.1%。DMEM（低糖）培養(yǎng)基購自GIBCO公司，四甲基耦氮唑藍(lán)（MTT）購自 Genview公司，臺盼藍(lán)購自Sigma公司，凋亡DNA Ladder提取試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter Epics XL）、二氧化碳培養(yǎng)箱（日本平澤制作所）、倒置顯微鏡（Olympus）、低溫超速離心機(jī)（Eppendorf 5417R型）、酶聯(lián)免疫檢測儀（南京華標(biāo)儀器廠）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法觀察RW對SW111C細(xì)胞增殖的抑制作用細(xì)胞以每孔5×103個，體積200μL接種于96孔板，37℃、5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。吸棄培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別用濃度為2、4、8、16、32mg／L的RW 藥液200μL處理；陰性對照組加入完全培養(yǎng)液200μL；調(diào)零組加入完全培養(yǎng)液200μL；各設(shè)復(fù)孔3個。注意在細(xì)胞加藥后的第2天進(jìn)行1／2的換液或換藥，分別培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72h后，每天取一塊板，吸棄培養(yǎng)液，加入濃度為5g／L的MTT，20μL／孔。繼續(xù)孵育4h后吸出各孔上清液，加入DMSO 150μL／孔，振蕩10min。酶標(biāo)儀以570nm為檢測波長測定各孔光密度值（A值）。細(xì)胞增殖的抑制率＝（對照組A值－用藥組A值）／對照組A值×100%。

1.2.2 臺盼藍(lán)拒染法檢測RW對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 培養(yǎng)細(xì)胞、藥物處理同MTT法，各設(shè)復(fù)孔3個。分別在48、72h后各取一塊板，對細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化，制備單細(xì)胞懸液。懸液均勻后，立即向一青霉素小瓶中滴入細(xì)胞懸液9滴，再滴入臺盼藍(lán)染液1滴，混勻，放置3～5min。在15min內(nèi)用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)200個細(xì)胞?；罴?xì)胞率＝未染色細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%，對照組活細(xì)胞率應(yīng)在90%以上。

1.2.3 瓊脂糖（DNA）凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期SW111C細(xì)胞以8×104個／mL接種于25mL培養(yǎng)瓶，每瓶2mL。細(xì)胞培養(yǎng)過夜，陰性對照組加入相應(yīng)體積的完全培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組分別加入2、8、32mg／L的藥液，每濃度組3瓶。藥物加入72h后進(jìn)行消化收集細(xì)胞。按照DNA Ladder抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作。將獲得的DNA應(yīng)用20g／L DNA凝膠電泳。電泳完成后取出凝膠于紫外透射儀下觀察并照相。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）PI染色法檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化 取對數(shù)生長期的細(xì)胞以8×104個／mL接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1mL。細(xì)胞培養(yǎng)過夜，陰性對照組加入相應(yīng)體積的完全培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組分別加入2、8、32mg／L的藥液，每個濃度加3瓶。藥物作用72h后收獲離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后再離心，70%的冷乙醇固定，4℃冰箱保存過夜。棄去70%的乙醇，用PBS漂洗后以100目篩網(wǎng)過濾，再離心（1000r／min，5min），棄PBS。加入PI工作液0.5mL，室溫避光30min，上機(jī)檢測。使用MultiCycle軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件，計量資料用表示。兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，對抑制率與RW濃度與作用時間進(jìn)行直線相關(guān)回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示RW對體外培養(yǎng)的SW111C細(xì)胞的生長具有抑制作用，隨著RW濃度的升高和時間的增長，其細(xì)胞增殖的抑制率明顯增加（表1）。

表1 RW對SW111C細(xì)胞抑制率的影響（，n＝3）

表1 RW對SW111C細(xì)胞抑制率的影響（，n＝3）

△:P＜0.05，＊:P＜0.01，與對照組同時間點(diǎn)比較。

組別抑制率（%）24h 48h 72h對照組000 RW 組（mg／L）2 2.95±1.376.96±1.6311.50±4.30＊4 3.80±1.8612.37±1.61△ 17.24±2.78＊8 8.43±1.2126.03±3.40＊ 30.11±3.52＊16 12.24±2.00△ 36.86±2.34＊ 41.30±4.72＊32 19.41±2.25＊ 45.62±1.85＊ 54.61±25.12＊

直線相關(guān)回歸分析表明，RW對SW111C細(xì)胞增殖的抑制作用具有劑量、時間依賴效應(yīng)。處理24、48、72h的IC50值分別為77.78、32.19、26.20mg／L。

2.2 臺盼藍(lán)拒染法檢測結(jié)果 經(jīng)RW作用48、72h后，隨著濃度的增大，SW111C細(xì)胞存活率逐漸降低（圖1）。

2.3 DNA凝膠電泳結(jié)果 RW作用72h后DNA抽提DNA凝膠電泳結(jié)果顯示，2.8mg／L RW組處理的SW111C細(xì)胞的DNA凝膠電泳圖譜未出現(xiàn)明顯可辨的“梯狀”條帶，32mg／L RW組的電泳圖譜出現(xiàn)“梯狀”條帶（圖2）。

圖1 RW對SW111C細(xì)胞存活率的影響

圖2 RW作用后細(xì)胞DNA凝膠電泳結(jié)果

表2 不同濃度的RW對SW111C細(xì)胞周期的影響（，n＝3）

表2 不同濃度的RW對SW111C細(xì)胞周期的影響（，n＝3）

＊:P＜0.01，與對照組比較。

組別細(xì)胞周期G1 S G2對照組56.7±2.5721.2±3.6322.1±3.06 RW 組（mg／L）2 63.2±1.33＊ 18.3±3.3218.5±2.518 65.7±2.48＊ 13.7±3.32＊ 20.6±2.2332 76.1±2.93＊ 11.5±2.84＊ 12.4±3.51＊

2.4 FCM檢測細(xì)胞周期和凋亡率的結(jié)果 RW作用72h后，SW111C細(xì)胞周期和凋亡率都發(fā)生了明顯的變化。隨著RW濃度的提高和作用時間的延長，G1期細(xì)胞明顯增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；S期細(xì)胞明顯減少，8、32 mg／L RW組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；G2期細(xì)胞減少，但不明顯。說明細(xì)胞大多阻滯于G1期，并呈一定的濃度依賴性（表2）。FCM結(jié)果顯示RW作用后都發(fā)現(xiàn)了位于G1期前的亞G1峰，凋亡率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且凋亡率呈濃度相關(guān)性（表3）。

表3 不同濃度的RW對SW111C細(xì)胞凋亡率的影響（，n＝3）

表3 不同濃度的RW對SW111C細(xì)胞凋亡率的影響（，n＝3）

＊:P＜0.01，與對照組比較。

組別凋亡率（%）對照組1.9±1.3 RW 組（mg／L）26.8±2.32＊8 11.8±2.58＊32 16.9±1.93＊

3 討 論

蛹蟲草中含有多種抗腫瘤活性成分，蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、超氧化物歧化酶、硒等，并且可單獨(dú)或共同發(fā)揮抗腫瘤作用［6－11］。本研究中的RW是從蛹蟲草提取出的活性成分。MTT法和臺盼藍(lán)拒染法檢測結(jié)果顯示RW在2～32 mg／L的濃度范圍內(nèi)對SW111C細(xì)胞增殖有不同程度抑制，抑制率與RW濃度和作用時間呈依賴關(guān)系。惡性腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常的疾病，也是細(xì)胞凋亡異常的疾?。?2］，細(xì)胞凋亡的減少可引起腫瘤的發(fā)生且通過逃避凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及演進(jìn)［13］。因此，抗癌藥物的療效不僅取決于藥物與各自靶點(diǎn)的相互作用，也取決于藥物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡的能力［14］。本實(shí)驗(yàn)中DNA凝膠電泳及FCM檢測結(jié)果顯示，RW可引起SW111C細(xì)胞的凋亡，且凋亡率呈濃度相關(guān)性，與MTT法測得的對增殖的抑制相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)RW作用72h后可使SW111C細(xì)胞受阻于G1期，導(dǎo)致S期細(xì)胞降低。而腫瘤細(xì)胞增殖的快慢，主要取決于細(xì)胞G0／G1期的長短，G0／G1期短，腫瘤細(xì)胞增殖快，處于G0／G1期的細(xì)胞數(shù)少［15］，故RW對SW111C細(xì)G1期阻滯可能使細(xì)胞生長周期延長，細(xì)胞的惡性增殖減慢。

綜上所述，RW對結(jié)腸癌細(xì)胞SW111C的生長具有明顯抑制作用，且這種抑制作用呈時間劑量依賴方式。這種對增殖的抑制作用與誘導(dǎo)SW111C細(xì)胞凋亡、改變其細(xì)胞周期分布有關(guān)。但RW由哪些物質(zhì)組成、具體哪些成分起作用等問題尚待進(jìn)一步研究；另一方面，更要進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究，開發(fā)出低毒、高效能的蛹蟲草提取物，為人類結(jié)腸癌的防治開拓新的途徑。

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