綦曉龍，陳川寧，徐 亮，吳曉霞

（瀘州醫(yī)學(xué)院:1.附屬醫(yī)院普外科；2.生物化學(xué)及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)教研室，四川 瀘州 646000）

樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）。DCs能有效地激活、誘導(dǎo)初始T細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答或免疫耐受，在免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)中的作用日益受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，隨著移植免疫反應(yīng)機(jī)制研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)DCs的成熟狀態(tài)是機(jī)體誘導(dǎo)移植排斥反應(yīng)或誘導(dǎo)移植耐受的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］，通過(guò)DCs誘導(dǎo)耐受是延長(zhǎng)移植物存活的有效方法。研究發(fā)現(xiàn)，ω－3PUFAs可使大鼠DCs的CD40、CD80、CD86及MHCⅡ等表型明顯下調(diào)，其抗原提呈功能也受到明顯影響［2］。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，ω－3PUFAs對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等多種自身免疫性疾病具有一定的治療作用，可以緩解上述疾病的病程進(jìn)展［3－4］，提示其可能與自體免疫反應(yīng)的抑制有關(guān)。本研究在體外以二十二碳六烯酸（DHA）處理DCs，觀察其對(duì)DCs細(xì)胞形態(tài)、免疫表型及細(xì)胞因子釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 RPMI－1640購(gòu)自Gibco公司；人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；rhGMCSF及rhIL－4購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；DHA、飽和脂肪酸（SA）及內(nèi)毒素脂多糖（LPS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒購(gòu)自BioBRK公司；ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；Wright－Giemsa染液購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；FITC標(biāo)記CD80、CD86及HLA－DR單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物

1.2 方法

1.2.1 DCs的誘導(dǎo)及培養(yǎng) 取健康成人外周血40mL，用肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），D－Hank′s液洗滌，用含10%胎牛血清 RPMI－1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種。放置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2h，吸棄細(xì)胞懸液，洗去非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的單個(gè)核細(xì)胞。加入含10%胎牛血清RPMI－1640完全培養(yǎng)基、rhGM－CSF、rhIL－4使其終濃度為:rhGM－CSF 500U／mL，rhIL－4250 U／mL。隔日半量換液，誘導(dǎo)5d。

1.2.2 DCs的處理和分組 將細(xì)胞分為4組，分別為未成熟組、成熟組、DHA組及SA組（飽和脂肪酸對(duì)照組），并行細(xì)胞爬片。分別將DHA和SA（均以50%乙醇溶解）加入相應(yīng)組的培養(yǎng)基中，使其終濃度為50μmol／L，未成熟組和成熟組則分別加入相應(yīng)劑量的乙醇作為平衡。第6天（脂肪酸作用24h后），除未成熟組外，各組分別加入LPS 100μg／L誘導(dǎo)DCs成熟，第8天（LPS作用48h后）收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 培養(yǎng)第8天時(shí)在細(xì)胞爬片中加入95%乙醇固定15min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，Wright－Giemsa染色，顯微鏡下觀察，攝片。

1.2.4 ELISA測(cè)定IL－12p70及TNF－α水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每組至少3復(fù)孔。取出酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)分別加入50μL的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；分別標(biāo)記樣品編號(hào)，加入50μL樣品于空白微孔中；在樣品孔中加入10μL生物素標(biāo)記液；在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入50～100μL酶標(biāo)記液；37℃孵育反應(yīng)60min；在孔板搖床上用洗滌液清洗5次，每次靜置10～20s；每孔加入底物（顯色劑）A、B液各50μL；37℃下避光孵育反應(yīng)15min；每孔加入50μL終止液終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)450nm測(cè)定各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.5 DCs表面相關(guān)表型的檢測(cè) 將不同時(shí)期的DCs用PBS調(diào)至4×105個(gè)／mL，加入離心管，每管200μL，加FITC標(biāo)記的CD80、CD86和 HLA－DR單抗，4℃ 標(biāo)記30min后，PBS洗滌，用600μL LPBS重懸細(xì)胞待測(cè)。

1.2.6 RT－PCR檢測(cè) DCs中 CD80、CD86、HLA－DR mRNA的表達(dá) RT－PCR步驟:（1）提取總RNA，冰上收集細(xì)胞加入1 mL冰TRNzol勻漿，依次經(jīng)氯仿、異丙醇等抽提總RNA。（2）RT反應(yīng)體系20μL，總RNA XμL（＜1μg），RNase free H2O（11－X）μL，5×RT Buffer 4μL，dNTP Mixture（10mM）2μL，Super－RI 0.5μL，RT－Enhancer 0.5μL，Oligo（dT）18 （50 pmol／μL）1μL，ReverTra Ace 1μL。反應(yīng)條件:30℃10min，42℃30min，99℃5min，4℃5min。（3）PCR反應(yīng)體系20 μL，RT產(chǎn)物2μL，RNase free H2O 6μL，2×Taq PCR Master－mix 10μL，上、下游引物（10pmol／μL）各1μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，取10μL PCR產(chǎn)物與上樣Buffer混勻，與PCR－Marker一起，在含1mg／mL溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外透射儀下觀察結(jié)果。電泳結(jié)果采用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并照相，黑馬凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳圖像，以目的基因擴(kuò)增量／內(nèi)對(duì)照（人GAPDH）基因擴(kuò)增量表示所要檢測(cè)基因的表達(dá)量，見(jiàn)表1。

2 結(jié) 果

2.1 DCs形態(tài)學(xué)觀察 鏡檢顯示，PBMC呈圓形，胞體小，黏附貼壁生長(zhǎng)。由GM－CSF、IL－4及LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的DCs細(xì)胞體積漸漸增大，細(xì)胞形態(tài)也不斷發(fā)生變化，由圓形變成梭形、星形或不規(guī)則形，胞漿變得豐富，細(xì)胞膜伸出很多不規(guī)則突出，并聚集成簇。培養(yǎng)8d的成熟組及SA組細(xì)胞呈現(xiàn)典型的DCs形態(tài)，胞體大，不規(guī)則，胞膜向外伸出毛刺狀或樹(shù)突狀突起，呈半貼壁生長(zhǎng)；DHA組則與未成熟組細(xì)胞形態(tài)類(lèi)似，見(jiàn)圖1。

圖1 各組培養(yǎng)后DCs經(jīng)Wright－Giemsa染色光鏡觀察結(jié)果（×400）

2.2 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè) 誘導(dǎo)第8天后，DCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)成熟組CD80、CD86及HLA－DR平均熒光強(qiáng)度明顯上調(diào)；其余3組無(wú)顯著差異。但是在其成熟過(guò)程中給予DHA干預(yù)后呈明顯下調(diào)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 DHA對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子水平的影響 以PBS為空白，以各標(biāo)準(zhǔn)OD值及對(duì)應(yīng)濃度制作IL－12p70及TNF－α標(biāo)準(zhǔn)曲線，IL－12p70回歸計(jì)算公式為Y＝0.0012 X＋0.22，直線相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9792；TNF－α回歸計(jì)算公式為Y＝0.0009 X＋0.0952，直線相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9924。ELISA結(jié)果顯示，成熟組與未成熟組相比，IL－12p70和TNF－α水平明顯提高。但是在其成熟過(guò)程中給予DHA干預(yù)，其產(chǎn)生的IL－12p70和TNF－α的水平則明顯下調(diào)，見(jiàn)表3、圖2。

表2 各組CD80、CD86及HLA－DR的平均熒光強(qiáng)度（，%）

表2 各組CD80、CD86及HLA－DR的平均熒光強(qiáng)度（，%）

△:P＜0.01，與未成熟組比較；▲:P＜0.01，與成熟組比較。

項(xiàng)目 未成熟組 成熟組 DHA組 SA組CD80 52.7±4.397.8±3.7△ 56.8±4.2▲58.6±5.3 CD86 55.0±3.496.1±1.3△ 60.5±3.8▲ 62.4±4.7 HLA－DR 80.4±7.698.6±3.6△ 81.6±4.6▲79.8±7.5

表3 各組IL－12p70和TNF－α的含量（，pg／mL）

表3 各組IL－12p70和TNF－α的含量（，pg／mL）

△:P＜0.01，與未成熟組比較；▲:P＜0.01，與成熟組比較。

項(xiàng)目 未成熟組 成熟組 DHA組 SA組IL－12p70189.7±16.3768.1±62.7△ 412.6±62.6▲709.5±47.8 TNF－α 637.6±38.42405.7±125.5△ 1807.4±140.3▲2353.4±194.7

圖2 各組IL－12p70及 TNF－α的含量（pg／mL）

2.4 DHA對(duì)DCs中CD80、CD86、HLA－DR mRNA表達(dá)的影響 CD80、CD86、HLA－DR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與各自GAPDH的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相比，結(jié)果顯示:CD80（F＝182.324，P＝0.000）、CD86（F＝104.611，P＝0.000）、HLADR（F＝205.319，P＝0.000）的4個(gè)組之間均有顯著差異（P＜0.01）；成熟組與未成熟組相比，有顯著差異（P＜0.01）；DHA組CD80、CD86及HLA－DR mRNA表達(dá)與成熟組相比均有所減低（P＜0.01），說(shuō)明DHA可有效抑制 DCs中CD80、CD86和HLA－DR mRNA的表達(dá)，而SA組CD80、CD86和 HLADR mRNA表達(dá)與成熟組比較無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 DHA對(duì)DCs表達(dá)CD80、CD86和HLADR mRNA的影響

3 討 論

DCs是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的APC，最大的特點(diǎn)是能顯著刺激初始型T細(xì)胞增殖［5］。而其他APC僅能刺激已活化的或記憶性T細(xì)胞，因此，DCs是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，在免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特的地位。成熟DCs表達(dá)高水平的共刺激分子CD80、CD86，它們與T細(xì)胞受體CD28結(jié)合，傳導(dǎo)正性共刺激信號(hào)，以激活初始型T細(xì)胞并促進(jìn)細(xì)胞因子IL－12的分泌［6］。而未成熟DCs只有低水平的MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)，同時(shí)缺乏刺激T細(xì)胞活化必需的輔助分子CD80、CD86等，體外激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)極弱，也不能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞活化。隨著免疫抑制治療的進(jìn)展，器官移植取得了很大進(jìn)步，但目前應(yīng)用的免疫抑制是以犧牲機(jī)體整體免疫功能為代價(jià)，且有不良反應(yīng)［7］，尋找新型的免疫抑制劑和誘導(dǎo)受者對(duì)供者抗原的特異性耐受是當(dāng)前移植學(xué)急需解決的問(wèn)題。

DCs是專(zhuān)職的APC，是眾所周知的高效APC，許多研究已經(jīng)證實(shí)DCs在決定耐受和免疫的平衡上起著關(guān)鍵的作用［8］。ω－3多不飽和脂肪酸中的DHA在體外可以顯著抑制DCs共刺激分子CD80、CD86以及表面抗原提呈分子HLA－DR的表達(dá)，從而干擾了DCs與T細(xì)胞之間的共刺激作用，使T細(xì)胞無(wú)法激活。所謂的成熟狀態(tài)不僅僅是對(duì)DCs功能的描述，還包括了它的表型特征。比如，當(dāng)DCs表面高表達(dá) MHC分子、CD40、CD80、CD83、CD86等時(shí)，它就被認(rèn)為是成熟［9］。這是因?yàn)镈Cs表面的分子與其對(duì)T細(xì)胞活化的能力是密切相關(guān)的，從免疫學(xué)的角度來(lái)講，一旦DCs表面分子的表達(dá)達(dá)到了成熟的“標(biāo)準(zhǔn)”，DCs也就進(jìn)入了成熟的功能狀態(tài)［10－11］。

DHA還可以抑制DCs細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL－12和TNF－α。IL－12p70是DCs成熟過(guò)程中分泌的一種標(biāo)志性的重要細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞，從而誘導(dǎo)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［12－13］。本研究結(jié)果顯示DHA使DCs分泌IL－12p70的水平降低至接近未成熟DCs水平。TNF－α是一種全身性炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)介質(zhì)，DHA明顯抑制DCs分泌TNF－α，抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖，是DCs誘導(dǎo)外周耐受的一種可能機(jī)制［14－15］。而DCs對(duì)Th1／Th2應(yīng)答平衡的調(diào)節(jié)是決定移植物排斥或耐受的另一重要機(jī)制之一［16－17］。因此，可以認(rèn)為DHA從細(xì)胞免疫表型的表達(dá)和細(xì)胞因子的釋放2個(gè)方面抑制了DCs對(duì)T細(xì)胞的激活能力。而SA在本實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)對(duì)DCs有明顯影響［18］。

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