胥 義 孫慧君 呂 婭

(上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093)

引言

關(guān)節(jié)軟骨能為關(guān)節(jié)活動提供低摩擦、低磨損和吸收力學(xué)沖擊等重要功能，但由于關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)和淋巴管提供營養(yǎng)，其自身修復(fù)能力很差，所以一旦損傷后，常常引發(fā)各種關(guān)節(jié)疾病，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。軟骨移植是修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的一種非?？煽康闹委熓侄危邢薜年P(guān)節(jié)軟骨供體來源及其保存問題，一直是制約關(guān)節(jié)軟骨移植手術(shù)得以推廣的主要原因[1]。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者都在探索關(guān)節(jié)軟骨的低溫保存技術(shù)[2-7]，期望能成功建立關(guān)節(jié)軟骨低溫保存組織庫，為臨床應(yīng)用提供豐富的材料來源，同時也便于醫(yī)生有足夠的時間，進(jìn)行術(shù)前更準(zhǔn)確的尺寸和形狀匹配以及充分的病毒學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢測等工作[8]。

但有研究發(fā)現(xiàn)，低溫冷凍軟骨移植后出現(xiàn)了軟骨組織纖維化[9]、軟骨基質(zhì)斷裂以及機械力學(xué)性能顯著降低[10-11]等問題。從現(xiàn)有的文獻(xiàn)調(diào)研來看，有關(guān)關(guān)節(jié)軟骨低溫保存過程中的生物力學(xué)性能變化的研究還很少，對其生物力學(xué)性能的低溫?fù)p傷機理至今不明確，這也是目前關(guān)節(jié)軟骨組織尚未完全成功保存的重要原因之一。事實上，在對其他生物組織材料進(jìn)行低溫保存時，常常也會觀察到低溫斷裂現(xiàn)象[12-14]?，F(xiàn)已明確造成生物材料低溫斷裂的主要原因是：由于生物材料中富含水分，在凍結(jié)過程中要發(fā)生較大體積膨脹率(一般認(rèn)為純水的凍結(jié)膨脹率約為9%[17])，材料外表面首先凍結(jié)，隨著溫度繼續(xù)降低，材料內(nèi)部也會隨之凍結(jié)膨脹，但由于受到外部已凍結(jié)固相的限制其膨脹，在材料內(nèi)部產(chǎn)生較大的熱應(yīng)力，當(dāng)該應(yīng)力得不到及時釋放時，必然導(dǎo)致生物材料宏(微)觀損傷[15]。

因此，系統(tǒng)研究生物材料凍結(jié)過程的熱膨脹行為，對于生物材料低溫凍結(jié)時的力學(xué)性能認(rèn)識是至關(guān)重要的。本研究探討降溫速率和低溫保護(hù)劑對軟骨在凍結(jié)過程熱膨脹行為的影響情況，這將非常有助于深入認(rèn)識關(guān)節(jié)軟骨低溫保存過程中的生物力學(xué)性能損傷機理，探索關(guān)節(jié)軟骨在這一溫區(qū)可能發(fā)生斷裂的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取上海本地成年豬，取整根有兩瓣半月板覆蓋白色軟骨的豬大骨。用手術(shù)剪將半月板剪去，并用專用工具(沖頭)制備直徑為5 mm的軟骨測試樣品。用格林氏液將樣品表面的滑液沖洗掉，再分別置于體積濃度為10%、30%、60%的低溫保護(hù)劑(二甲基亞砜、甘油和1，2丙二醇，均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)中進(jìn)行2.5 h的充分滲透，即用低溫保護(hù)劑將軟骨內(nèi)的水分充分置換，并存于4℃冰箱貯存以備實驗時取用。

1.2 測試方法

1.2.1 含水量的測試

采用醫(yī)用真空干燥箱(DZF系列真空干燥箱，上海華連醫(yī)療器械有限公司)，在進(jìn)行真空干燥前，務(wù)必用濾紙將樣品表面的水分吸干，真空度為50 Pa，溫度50℃，連續(xù)干燥6 h。并用天平精確稱量樣品干燥前后重量，按如下公式計算：

式中，Wi為樣品初始重量(g);Wf為樣品干燥后的重量(g)。

1.2.2 熱應(yīng)變的測試

用熱機械分析儀 (TMA Q400，TA，USA)作為測試儀器(壓縮模式)。測試方法如下：(1)將直徑為5 mm、厚度為3～4 mm的樣品置于壓縮夾具中心位置;(2)關(guān)閉爐蓋，將爐腔體冷卻至0℃;(3)加載微小載荷0.005 N，以確保樣品與夾具充分接觸，但又不至于造成樣品變形，讀取此時樣品的厚度為初始厚度;(4)以一定的降溫速率進(jìn)行程序降溫至-100℃，記錄整個過程樣品厚度的變化。熱應(yīng)變值可以按下式計算獲得：

式中，L0為樣品初始厚度 (mm);L(T)為樣品在降溫過程中的厚度 (mm);ε(T)為樣品熱應(yīng)變。

為確保實驗數(shù)據(jù)的可靠性，所有實驗做3次平行樣，并取平均值。

1.2.3 凍結(jié)相變過程最大熱應(yīng)變變化值的確定

如圖1所示，圖中為樣品熱應(yīng)變實驗曲線，隨著溫度降低到A點時，熱應(yīng)變突然增大，此時開始發(fā)生凍結(jié)相變過程，達(dá)到B點時，熱應(yīng)變值達(dá)到最大，隨著溫度的繼續(xù)降低，熱應(yīng)變則會逐漸減小。根據(jù)生物材料凍結(jié)特點，可以認(rèn)為從A點到B點的過程即為凍結(jié)相變過程，且這兩點之間所經(jīng)歷的時間亦為這一相變過程時間。因此，所討論凍結(jié)相變過程最大熱應(yīng)變變化值為實驗曲線中A、B兩點對應(yīng)的熱應(yīng)變值之差，即

圖1 樣品凍結(jié)過程熱應(yīng)變曲線Fig.1 Thermal strain curve of sample during freezing

2 實驗結(jié)果

2.1 取樣位置對凍結(jié)過程熱膨脹的影響

關(guān)節(jié)軟骨表面呈球面分布，關(guān)節(jié)軟骨的厚度以及主要基質(zhì)含量在不同的部位是不均勻的，這種差異可能是由關(guān)節(jié)不同部位所受負(fù)荷不同而造成的[16]。因此，可以推斷：完整關(guān)節(jié)軟骨在進(jìn)行凍結(jié)保存時，可能會由于其中水分等分布不均勻，而影響關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)熱膨脹(或收縮)效果，而最終引起關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)熱應(yīng)力分布不均。為了驗證這個推測，分別測試了關(guān)節(jié)軟骨不同部位處的熱應(yīng)變變化值，以及對應(yīng)的水分含量。

圖2所示為關(guān)節(jié)軟骨表面不同取樣位置示意圖，圖3為樣品經(jīng)過3℃/min降溫時的凍結(jié)過程熱應(yīng)變曲線。從圖3中可以看出，隨著溫度的降低直到初始凍結(jié)溫度(大約在 -23℃至 -28℃之間)，所有樣品都有較為明顯的熱應(yīng)變減小過程。當(dāng)達(dá)到初始凍結(jié)溫度后，熱應(yīng)變均在極短的溫度范圍內(nèi)陡然增大，之后隨著溫度的進(jìn)一步降低，熱應(yīng)變又較緩地線性減小。

表1對比了不同取樣位置樣品在凍結(jié)相變過程中熱應(yīng)變變化值，以及相對應(yīng)的水分含量值。很明顯，從不同位置取樣的樣品含水量差異性較大，且樣品凍結(jié)過程的熱應(yīng)變變化值與樣品的含水量有密切關(guān)系。中心區(qū)域Ⅴ的含水量最低(約為70%)，其對應(yīng)的熱應(yīng)變變化值為3.20%，而內(nèi)、外側(cè)(即Ⅳ、Ⅲ)區(qū)域含水量最高(約為79%)，其對應(yīng)的熱應(yīng)變變化值也最大，達(dá)到5.10%左右，前、后側(cè)(即Ⅰ、Ⅱ)的含水量和最大熱應(yīng)變變化值均居于中等水平。

圖2 關(guān)節(jié)軟骨表面取樣位置示意圖(Ⅰ，Ⅱ分別為前后側(cè);Ⅲ，Ⅳ分別為內(nèi)外側(cè);Ⅴ為中心區(qū)域)Fig.2 Sampling location on the articular cartilage surface.Ⅰ， Ⅱ are front side and backside zones.Ⅲ，Ⅳ are inside and outside zones.Ⅴ is central zone

圖3 不同取樣位置樣品的凍結(jié)熱應(yīng)變Fig.3 Thermal strain of specimens extracted from five distinct zones of cartilage surface

表1 不同取樣位置樣品的含水量以及凍結(jié)過程最大熱應(yīng)變變化值Tab.1 Water content，maximal thermal strain change value during freezing phase change of samples from five distinct zones

2.2 降溫速率對凍結(jié)過程熱膨脹的影響

圖4是降溫速率對關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)過程熱應(yīng)變的影響。從圖中可以明顯看出，在凍結(jié)相變發(fā)生前，降溫速率越慢，熱應(yīng)變減小幅度越大。而從表2可以看出，降溫速率越快，其凍結(jié)過程最大熱應(yīng)變變化值越大，所對應(yīng)的時間越短，例如，5℃/min時的最大熱應(yīng)變變化值5.39% ±0.05%是1℃/min(最大熱應(yīng)變變化值為3.73% ±0.06%)的1.45倍，但后者所需時間是前者的3倍。但在凍結(jié)相變結(jié)束后，3種降溫速率下的熱應(yīng)變均呈平行直線緩慢較小，沒有大的差異性。

2.3 低溫保護(hù)劑對凍結(jié)膨脹的影響

圖4 降溫速率對熱應(yīng)變的影響Fig.4 Thermal strain as affected by freezing rates

表2 不同降溫速率和不同低溫保護(hù)劑濃度時的相變溫度、最大熱應(yīng)變變化值及其對應(yīng)的時間間隔Tab.2 Phase change temperatures，maximum change value of thermal strains and corresponding time for reaching the phase change under different freezing rates and CPA concentrations

圖5 二甲基亞砜濃度對熱應(yīng)變的影響Fig.5 Thermal strain as affected by different DMSO concentrations

圖5給出了樣品經(jīng)過不同二甲基亞砜濃度處理后的凍結(jié)過程熱應(yīng)變變化情況(降溫速率為3℃/min)。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，與新鮮關(guān)節(jié)軟骨相比，二甲基亞砜能夠顯著抑制其凍結(jié)過程的熱膨脹，而且二甲基亞砜濃度越高，這種抑制越明顯。特別是當(dāng)二甲基亞砜濃度足夠高時，如達(dá)到60%(v/v)，整個降溫過程的熱應(yīng)變呈線性下降，不再出現(xiàn)熱膨脹突變現(xiàn)象。從表2中還可以看出，隨著二甲基亞砜濃度的增加，凍結(jié)相變膨脹量越小，例如30%(v/v)二甲基亞砜的熱膨脹量只有新鮮軟骨凍結(jié)膨脹的40%左右，但它對應(yīng)轉(zhuǎn)變時間卻是后者的5.25倍。另外，從圖5和表2中均可發(fā)現(xiàn)，一旦樣品經(jīng)過二甲基亞砜保護(hù)后，其初始凍結(jié)溫度也會隨其濃度增大而減小，這是符合稀溶液依數(shù)性質(zhì)的[17]。

圖5 對比了 Jimenez Rios[20]的研究結(jié)果，該文獻(xiàn)測量了血管材料經(jīng)過7.05 M二甲基亞砜(相當(dāng)于50%～60%(v/v)二甲基亞砜)保護(hù)后的降溫過程熱應(yīng)變變化情況。他們認(rèn)為此濃度下的生物材料凍結(jié)過程不再有冰晶出現(xiàn)，可以實現(xiàn)玻璃化保存，因而其降溫過程的熱應(yīng)變呈線性減小。

圖6 低溫保護(hù)劑種類對熱應(yīng)變的影響。(a)10%(v/v);(b)30%(v/v);(c)60%(v/v)Fig.6 Thermal strain as affected by different CPAs.(a)10%(v/v);(b)30%(v/v);(c)60%(v/v)

圖6比較了二甲基亞砜、甘油、1，2丙二醇等3種低溫保護(hù)劑在不同濃度下對關(guān)節(jié)軟骨降溫過程熱應(yīng)變的影響。結(jié)合表2來看，甘油和丙二醇也是隨著濃度增大，其最大凍結(jié)膨脹形變量減小，以及其初始凍結(jié)溫度降低，這與二甲基亞砜的趨勢是一樣的。且達(dá)到60%(v/v)時，均無凍結(jié)熱膨脹突變現(xiàn)象。但與二甲基亞砜不同的是：在低濃度區(qū)域，這兩者對關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)膨脹的抑制效果較小，例如10%(v/v)和30%(v/v)時，這兩者的最大熱應(yīng)變變化值分別是4.20%±0.02%和3.10%±0.10%以及4.50% ±0.10%和2.90% ±0.10%，均大于二甲基亞砜(分別是3.22% ±0.07%和2.53% ±0.08%)。

3 討論

圖3中熱應(yīng)變隨著溫度降低而減小，直到溫度降至初始凍結(jié)溫度后，熱應(yīng)變均在極短的溫度范圍內(nèi)陡然增大，之后隨著溫度的進(jìn)一步降低，熱應(yīng)變又較緩地線性減小。對于這一現(xiàn)象解釋如下：相變前的熱收縮由于軟骨內(nèi)各基質(zhì)分子(如水分子、膠原蛋白等)之間距離隨著溫度降低而導(dǎo)致的宏觀收縮現(xiàn)象;但當(dāng)溫度降低至初始凍結(jié)溫度時，熱應(yīng)變突然增大，這主要是因為樣品中自由水快速轉(zhuǎn)變冰晶膨脹所致;而隨著溫度的繼續(xù)降低，其熱應(yīng)變值繼續(xù)緩慢減小，這也是由于冷凍關(guān)節(jié)軟骨中被固化基質(zhì)分子之間距離隨溫度降低而收縮所致。而表1的結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨表面因長期所受不均勻負(fù)荷，造成不同區(qū)域的含水量有較大差異，在進(jìn)行完整關(guān)節(jié)軟骨低溫凍結(jié)保存時，不可避免地存在非均勻熱膨脹現(xiàn)象，很可能導(dǎo)致完整關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部熱應(yīng)力的產(chǎn)生，并損傷關(guān)節(jié)軟骨中的膠原纖維等成分，這或許是完整關(guān)節(jié)軟骨至今未能得以成功保存的重要原因。有關(guān)這一結(jié)論，還需要更進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)觀察驗證。

至于降溫速率對凍結(jié)相變發(fā)生前的熱應(yīng)變減小與降溫速率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的主要原因是：在凍結(jié)發(fā)生前，關(guān)節(jié)軟骨中的水分子雖然受降溫的影響而縮短彼此間的距離，但它們同時又受到蛋白多糖、膠原纖維以及電荷的共同作用，表現(xiàn)出典型的粘彈性特點，存在應(yīng)變松弛現(xiàn)象，從而抑制這種水分子之間距離減小的趨勢;特別是當(dāng)快速降溫時，達(dá)到凍結(jié)相變點溫度的時間更短，水分子之間的距離還沒有來得及減小到穩(wěn)定狀態(tài)，就發(fā)生了凍結(jié)相變過程，因而凍結(jié)發(fā)生前的熱收縮越小。而表2中表明：降溫速率越快，其凍結(jié)過程最大熱應(yīng)變變化值越大，其所對應(yīng)的時間越短。據(jù)此可以推測：當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)歷快速降溫時，其較大的熱膨脹必然產(chǎn)生較大的熱應(yīng)力，但在短時間內(nèi)又無法釋放這些熱應(yīng)力，必將導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部基質(zhì)(如膠原纖維)的微結(jié)構(gòu)損傷，甚至帶來宏觀低溫斷裂現(xiàn)象。

從表2中還可以看出，隨著二甲基亞砜濃度的增加，凍結(jié)相變膨脹量越小，這說明經(jīng)過較高濃度二甲基亞砜保護(hù)后的關(guān)節(jié)軟骨，在凍結(jié)過程中產(chǎn)生較小的熱應(yīng)力，對關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部膠原纖維等基質(zhì)造成的微觀損傷較小，從而起到保護(hù)的作用。特別是當(dāng)采用60%(v/v)二甲基亞砜作為低溫保護(hù)劑時，其降溫過程不再出現(xiàn)熱膨脹突變現(xiàn)象的原因，就是實現(xiàn)了關(guān)節(jié)軟骨的玻璃化保存，避免了冰晶產(chǎn)生和生長所帶來的熱膨脹。因此，高濃度低溫保護(hù)劑對于關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的力學(xué)性能保護(hù)是非常有益的，但是，高濃度低溫保護(hù)劑可能也會對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以及其他活性物質(zhì)造成不可逆損傷，這個問題還需要進(jìn)一步探索。

從圖6和表2可以看出，二甲基亞砜、甘油、1，2丙二醇三種低溫保護(hù)劑在不同濃度下對關(guān)節(jié)軟骨降溫過程熱應(yīng)變有不同程度的影響，要采用低濃度低溫保護(hù)劑時，選擇二甲基亞砜更適合，但這3種保護(hù)劑在高濃度區(qū)域的保護(hù)能力沒有太大差別。

4 結(jié)論

采用熱機械分析儀TMA，研究了豬關(guān)節(jié)軟骨從0～100℃范圍內(nèi)降溫過程熱膨脹行為，得出以下結(jié)論：

1)關(guān)節(jié)軟骨表面不同區(qū)域的含水量有較大差異，在進(jìn)行完整關(guān)節(jié)軟骨低溫凍結(jié)保存時，不可避免地存在非均勻熱膨脹現(xiàn)象，很可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部熱應(yīng)力的產(chǎn)生，并損傷關(guān)節(jié)軟骨中的膠原纖維等成分，這很可能是完整關(guān)節(jié)軟骨至今未能得以成功保存的重要原因。

2)當(dāng)降溫速率較大時，突變前后的應(yīng)變差較大，這說明，低溫膨脹可能造成關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部組織損傷，由于膨脹所產(chǎn)生的應(yīng)力來不及釋放，可能會帶來嚴(yán)重的低溫斷裂問題，因此慢速降溫可能更適合于關(guān)節(jié)軟骨的低溫保存。

3)高濃度低溫保護(hù)劑對于關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的力學(xué)性能保護(hù)是非常有益的，但是，高濃度低溫保護(hù)劑可能也會對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以及其他活性物質(zhì)造成不可逆損傷，這個問題還需要進(jìn)一步探索。此外，使用低濃度低溫保護(hù)劑時，與甘油和丙二醇相比，二甲基亞砜更適合保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

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