仇雪梅吳領(lǐng)知郭曉黎張偉杰叢玉婷

常亞青1、2,宋堅1、2,劉洋2,王秀利2

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023)

蝦夷馬糞海膽CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

仇雪梅1、2,吳領(lǐng)知2,郭曉黎2,張偉杰1,叢玉婷2,

常亞青1、2,宋堅1、2,劉洋2,王秀利2

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023)

采用RT-PCR、PCR-SSCP等分子生物學(xué)技術(shù)和關(guān)聯(lián)分析等方法對蝦夷馬糞海膽StrongylocentrotusintermediusCYP51基因的cDNA序列進(jìn)行了克隆和單核苷酸多態(tài)性分析。結(jié)果表明:蝦夷馬糞海膽的CYP51基因包括一個1 491 bp的開放閱讀框,編碼496個氨基酸;其開放閱讀框的第161個核苷酸處存在1個單核苷酸多態(tài)性,即核苷酸發(fā)生了A→G突變。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,該單核苷酸多態(tài)性與蝦夷馬糞海膽的體質(zhì)量、性腺質(zhì)量之間存在顯著相關(guān)性 (P＜0.05)。本研究中首次克隆了蝦夷馬糞海膽CYP51基因的cDNA序列并進(jìn)行了SNPs分析,研究結(jié)果可為蝦夷馬糞海膽的分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

蝦夷馬糞海膽;CYP51基因;克隆;單核苷酸多態(tài)性

細(xì)胞色素P450基因家族編碼的酶系在內(nèi)源性物質(zhì) (如激素)和外源性物質(zhì) (如藥物、環(huán)境化合物)的代謝過程中起著重要作用[1]。CYP51基因是P450超基因家族重要的成員,它是P450家族中唯一廣泛分布于各種真核生物,甚至是一些原核生物中的成員[2-4]。CYP51基因編碼的14α-去甲基酶是甾醇合成過程中的關(guān)鍵酶之一[5]。該酶的主要功能是催化甾醇前體14α-甲基羥基化的反應(yīng),生成的終產(chǎn)物在動物中為膽固醇,在真菌中為麥酵素,在植物和原生動物中為多種24-烷基化和烯烴化甾醇[6]。在哺乳動物體內(nèi),14α-去甲基酶的直接產(chǎn)物FF-MAS,不僅是膽固醇合成過程的中間產(chǎn)物,更是被確定為促減數(shù)分裂甾醇 (meiosis-activating sterol,MAS)[7]。減數(shù)分裂是動物有性繁殖過程中生成單倍體配子的關(guān)鍵步驟,因此,MAS在性腺中的合成、分布及其與單倍體配子生成的關(guān)系已經(jīng)成為CYP51基因研究的一個熱點。

與其它物種相比,棘皮動物CYP51基因的研究并不是很深入。而對于海膽這種以性腺為主要經(jīng)濟(jì)性狀的動物來說,生殖細(xì)胞形成、成熟過程的調(diào)控對性腺的發(fā)育分化,甚至整個個體生長發(fā)育的影響極有可能更為突出。蝦夷馬糞海膽Strongylocen-trotusintermedius又稱中間球海膽,原產(chǎn)于日本北海道及俄羅斯薩哈林島等地,因其性腺色澤好、味甜、經(jīng)濟(jì)價值高、國際市場需求量高,中國于1989年從日本引進(jìn)了該品種。目前,蝦夷馬糞海膽已經(jīng)成為中國重要的經(jīng)濟(jì)海膽之一,發(fā)展前景良好。本研究中作者首次克隆了蝦夷馬糞海膽的CYP51基因,并進(jìn)行了該基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNPs) 與殼高、殼徑、性腺質(zhì)量、體質(zhì)量等生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析,為進(jìn)一步明確CYP51基因的功能,以及為蝦夷馬糞海膽的分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物:蝦夷馬糞海膽由大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室提供,26月齡,共180個。

主要試劑:rTaq DNA聚合酶、dNTPs、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、PMDT-19載體、DNA切膠回收試劑盒等均購自寶生物工程 (大連)有限公司;Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 生長性狀的測定 測定蝦夷馬糞海膽的殼高、殼徑和體質(zhì)量等生長性狀后,取性腺,測定性腺質(zhì)量,并將性腺迅速放入冰箱(-80℃)中保存。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 取蝦夷馬糞海膽性腺組織100 mg,按照Trizol總RNA提取試劑說明書所提供的方法進(jìn)行總RNA的提取,并用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA。對提取的RNA,按照試劑盒說明書所提供的方法用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈。

1.2.3 蝦夷馬糞海膽性腺基因組的提取 采用常規(guī)酚氯仿法抽提蝦夷馬糞海膽基因組DNA,用TE緩沖液溶解,并在4℃下保存。

1.2.4 引物合成和PCR擴(kuò)增 從美國國立生物技術(shù)信息中心 (NCBI)網(wǎng)站上下載紫球海膽Strongylocentrotuspurpuratus等幾個不同物種的CYP51基因序列。根據(jù)保守區(qū)域和紫球海膽CYP51基因非編碼區(qū)序列,設(shè)計出3對引物用于CYP51基因的克隆 (表1)。引物由寶生物工程 (大連)有限公司合成。

表1 用于RT-PCR擴(kuò)增的CYP51基因引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in RT-PCR am p lification of CYP51 gene

在獲得蝦夷馬糞海膽CYP51基因的cDNA序列后,對其外顯子部分設(shè)計了7對適于PCR-SSCP分析的引物,用于SNPs分析 (表2)。

表2 用于PCR-SSCP分析的CYP51基因引物序列Tab.2 Sequences of the primers used in PCR-SSCPCYP51 gene analysis

PCR反應(yīng)體系共25μL,包括:模板DNA 1 μL,上、下游引物各 1μL,10×PCR 緩沖液(Mg2+plus)2.5μL,dNTPs 2μL,rTaq 0.5μL,用ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)程序為:95℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,退火 (退火溫度如表1和表2所示)45 s,72℃下延伸30 s,共進(jìn)行30個循環(huán);最后在72℃下延伸7 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量,以決定下一步SSCP試驗中的用量。

1.2.5 PCR-SSCP分析[8]在干凈的PCR管中加入5μL上樣緩沖液 (98%甲酰胺,0.025%酚藍(lán), 0.025%二甲苯酚,2%甘油,10 mol/L pH為8.0的EDTA)和1～2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,于98℃下變性10 min后,立即冰浴10 min。將變性后的PCR產(chǎn)物用 120 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE 30%,Acr∶Bis=29∶1)電泳,在110 V下預(yù)電泳30 min,在120 V下電泳14～16 h,用硝酸銀顯色后,判別基因型并掃描保存。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的回收和測序 用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物后,連接到pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。菌液經(jīng)PCR檢測后,用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.7 序列分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 利用DNAStar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接,用NCBI網(wǎng)站上的Blast和Blastx程序?qū)寺～@得的序列進(jìn)行比對。用Expasy網(wǎng)站提供的ProtParam程序預(yù)測由cDNA序列推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)的分子量、等電點等理化性質(zhì);用Sosui程序預(yù)測該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。運用Clustal W軟件對不同物種CYP51基因的氨基酸序列進(jìn)行在線比對,并運用Mega 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

采用遺傳信息多樣性分析軟件PopGen32和多態(tài)信息含量軟件PIC-Calc 0.6計算群體遺傳多樣性指標(biāo)。采用SPSS 17.0軟件,運用最小二乘法擬合線性模型分析CYP51基因部分外顯子不同基因型個體與海膽生長性狀之間的相關(guān)性,以P＜0.05為差異顯著。模型為[9]

Yij=μ+Gi+Eij,

其中:Yij為生長性狀觀測值;μ為生長觀測值的均值;Gi為基因型效應(yīng);Eij為隨機(jī)誤差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 蝦夷馬糞海膽性腺總RNA的提取和質(zhì)量鑒定

蝦夷馬糞海膽性腺總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。從圖1清晰可見28S、18S和5S 3條RNA條帶,其中28S RNA條帶和18S RNA條帶的亮度和寬度比值接近2∶1,5SRNA條帶相對比較淡,其A260nm/A280nm值為1.93,說明蝦夷馬糞海膽性腺總RNA的提取比較完整,可用于下一步試驗。

圖1 蝦夷馬糞海膽性腺總RNA的電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram of gonad RNA inStrongylocentrotus intermedius

2.2 用RT-PCR法克隆蝦夷馬糞海膽CYP51基因的cDNA及序列分析

以蝦夷馬糞海膽性腺總RNA為模板,用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄出蝦夷馬糞海膽cDNA第一鏈。然后,以上述 cDNA第一鏈為模板,用引物 HF/HR、MF/MR和LF/LR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期一致,分別在570、656、375 bp處有清晰的條帶,且無非特異性擴(kuò)增條帶(圖2)。

圖2 引物HF/HR、MF/MR、LF/LR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of HF/HR,MF/MR and LF/LR prim ers

將HF/HR、MF/MR、LF/LR 3對引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果,除去載體序列并用DNAStar進(jìn)行拼接后獲得了1 536 bp的片段。利用Blast程序?qū)ζ唇雍蟮男蛄羞M(jìn)行比對,確定該序列為蝦夷馬糞海膽CYP51基因的 cDNA序列,其中包括了1 491 bp的開放閱讀框,共編碼496個氨基酸。該序列已經(jīng)被提交到 GenBank中,注冊號為JN207907。

運用ProtParam軟件預(yù)測蝦夷馬糞海膽CYP51基因編碼蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果顯示,其相對分子量為56 191.7,等電點為7.14,是一個跨膜蛋白。該蛋白具有一個跨膜螺旋,氨基端位于胞外,羧基端位于胞內(nèi),第15至第37位的氨基酸構(gòu)成了疏水的跨膜結(jié)構(gòu)。

對蝦夷馬糞海膽CYP51基因的cDNA序列進(jìn)行Blastx分析,結(jié)果顯示,其與人Homosapiens(HSU23942)、鼠Musmusculus(NM_020010)、牛Bostaurus(NP_001020490)、豬Susscrofa(BAI47778)、雞Gallusgallus(NP_001041542)、非洲蛙Xenopustropicalis(NP_001016194)、非洲爪蛙Xenopuslaevis(NP_001087776)、斑馬魚Daniorerio(AAR89625)等脊椎動物的相似性分別為67%、66%、69%、69%、74%、70%、70%、69%,而與紫球海膽 (AY496941)的相似性高達(dá)99%。用Mega 4軟件對上述9種動物CYP51基因的氨基酸序列與本研究克隆的蝦夷馬糞海膽CYP51基因的氨基酸序列 (JN207907)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果見圖3。從圖3可見,兩種海膽與其它脊椎動物分離而歸屬于一個進(jìn)化枝。從比對結(jié)果和進(jìn)化樹分析結(jié)果可知,海膽的CYP51基因具有種屬特異性,而且在進(jìn)化過程中高度保守。

圖3CYP51基因的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of am ino acid sequences in CYP51 gene

2.3 蝦夷馬糞海膽CYP51基因部分外顯子的PCR-SCCP分析

用蝦夷馬糞海膽基因組DNA為模板,用表2所示的7對引物進(jìn)行PCR-SSCP分析,7對引物全部獲得清晰且與預(yù)期一致的PCR產(chǎn)物。圖4為引物F2/R2的PCR產(chǎn)物,對該PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析 (圖5),結(jié)果出現(xiàn)3種基因型:野生型基因型AA和有突變的基因型BB、AB。

圖4 引物F2/R2的PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR products of prim er F2/R2

圖5 引物F2/R2對PCR產(chǎn)物的SSCP分析Fig.5 SSCP analysis of PCR product of primer F2/R2

2.4 蝦夷馬糞海膽CYP51基因部分外顯子的序列及SNPs分析

根據(jù)PCR-SSCP分析結(jié)果,分別選擇AA、BB基因型個體 (各3個個體)的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。用Mega 4軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比較后,發(fā)現(xiàn)蝦夷馬糞海膽CYP51基因 (JN207907)開放閱讀框的第161個核苷酸發(fā)生了A→G的SNP突變。該單核苷酸突變位點位于密碼子的第二位堿基,導(dǎo)致氨基酸序列第54位氨基酸由組氨酸 (His,H)變?yōu)榫彼?Arg,R)。

2.5 蝦夷馬糞海膽CYP51基因部分外顯子多態(tài)位點的遺傳分析

對蝦夷馬糞海膽CYP51基因部分外顯子多態(tài)位點的遺傳分析結(jié)果表明:3種不同基因型AA、AB、BB的頻率分別為0.5167、0.2778、0.2056,等位基因A和B的頻率分別為0.6556、0.3444,該位點的雜合度 (He)、純合度 (Ho)、多態(tài)信息含量 (PIC)和有效等位基因數(shù) (ENA)分別為0.4529、0.5471、0.3496、1.8235。

2.6 蝦夷馬糞海膽CYP51基因部分外顯子多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用最小二乘法分析蝦夷馬糞海膽CYP51基因的不同基因型對180個蝦夷馬糞海膽個體的殼徑、殼高、體質(zhì)量、性腺質(zhì)量等4個生長性狀的影響,結(jié)果見表3。從表3可見,不同基因型蝦夷馬糞海膽的體質(zhì)量和性腺質(zhì)量存在顯著差異 (P＜0.05)。其中AA基因型個體的性腺質(zhì)量和體質(zhì)量均顯著高于AB、BB基因型個體 (P＜0.05),但AB、BB基因型個體的性腺質(zhì)量和體質(zhì)量之間均無顯著差異 (P＞0.05);不同基因型個體的殼高、殼徑之間均無顯著差異 (P＞0.05)。

表3 對蝦夷馬糞海膽個體生長性狀的最小二乘法分析結(jié)果(平均值±S.E.)Tab.3 The least square analysis of grow th traits in the sea urchin(mean±S.E.)

3 討論

CYP51基因編碼的甾醇14α-去甲基酶參與一些生物活性分子的代謝,所以CYP51基因在動植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用已成為CYP51基因的研究重點[10-11]。本研究中不僅首次克隆了蝦夷馬糞海膽CYP51基因的cDNA序列,并對其進(jìn)行了SNPs分析。據(jù)報道,真核生物的CYP51都是相對分子量為55 000左右的跨膜蛋白[12],本研究中得到的蝦夷馬糞海膽CYP51基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果與這一報道一致。根據(jù)不同物種CYP51基因的氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示,蝦夷馬糞海膽和紫球海膽的CYP51同源性較高,與其它脊椎動物分離而歸屬于一個進(jìn)化枝。脊椎動物中哺乳動物、鳥類CYP51與海膽CYP51的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn),而兩棲類、魚類CYP51與海膽CYP51的親緣關(guān)系相對較近。這一結(jié)果與CYP51在整個生物界由低等到高等的進(jìn)化趨勢相符。

氨基酸序列比對結(jié)果顯示,底物結(jié)合區(qū)和血紅素輔基結(jié)合區(qū)等保守區(qū)域均能在蝦夷馬糞海膽中找到。與其它細(xì)胞色素P450不同,CYP51不僅有高度保守的血紅素輔基結(jié)合區(qū),其底物結(jié)合區(qū)也是高度保守的[12]。序列的保守性是和嚴(yán)格的催化活性聯(lián)系在一起,由此可以推測,蝦夷馬糞海膽CYP51的催化功能與其它物種的CYP51基本上是相同的。在哺乳動物體內(nèi),14α-去甲基酶 (CYP51)的直接產(chǎn)物是從羊毛甾醇上移去14α-甲基而生成FFMAS。FF-MAS不僅是膽固醇合成過程中的中間產(chǎn)物,而且FF-MAS和以它為底物合成的睪丸促減數(shù)分裂甾醇 (testis meiosis-activating sterol,TMAS)都是促減數(shù)分裂甾醇。在哺乳動物中,FFMAS和T-MAS存在于卵泡液和睪丸組織中[13],對生殖細(xì)胞的形成和成熟過程有重要的調(diào)節(jié)作用,即在輔助生殖學(xué)中扮演著重要角色。體外試驗證明,FF-MAS和T-MAS在體外都可以恢復(fù)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂[13-14]。因此,上述兩種減數(shù)分裂甾醇在生殖調(diào)控中的作用越來越受到人們的關(guān)注。已有研究顯示,小鼠FSH(促卵泡素)誘導(dǎo)的促減數(shù)分裂作用需要CYP51基因的激活[15]。而在已經(jīng)完成減數(shù)分裂的精細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)T-MAS[16],預(yù)示著T-MAS的功能不只限于促減數(shù)分裂的恢復(fù)。

PCR-SSCP分析結(jié)果顯示,蝦夷馬糞海膽CYP51基因開放閱讀框的第161個核苷酸處的單核苷酸多態(tài)性 (A→G)與蝦夷馬糞海膽的性腺質(zhì)量和體質(zhì)量之間存在顯著相關(guān)性 (P＜0.05),即該位點的突變對蝦夷馬糞海膽的性腺和個體發(fā)育的影響顯著。雖然,上述單核苷酸突變導(dǎo)致氨基酸序列第54位氨基酸由組氨酸 (His,H)變?yōu)榫彼?Arg,R),但是這種氨基酸的改變是如何影響14α-去甲基酶 (CYP51)功能的具體機(jī)理尚不清楚。Byskov等[17]對哺乳動物的研究表明,T-MAS濃度和睪丸質(zhì)量呈正相關(guān)。由此推測,該突變可能影響了蝦夷馬糞海膽體內(nèi)MAS的濃度,從而對性腺質(zhì)量和體質(zhì)量產(chǎn)生了影響。

生殖細(xì)胞的形成、成熟跟它所處的環(huán)境即性腺的營養(yǎng)、發(fā)育、生長狀況等因素都有著密切的聯(lián)系,生殖細(xì)胞的生成和性腺發(fā)育分化是互動的過程。從上述突變對性腺質(zhì)量和體質(zhì)量產(chǎn)生的影響可知,蝦夷馬糞海膽的CYP51基因能通過生殖細(xì)胞生成過程的調(diào)控,對性腺甚至是個體的生長發(fā)育起著調(diào)節(jié)作用。與其它動物相比,蝦夷馬糞海膽的性腺占海膽個體體質(zhì)量的百分比 (即性腺指數(shù))較高,一般在10%～20%,因此,CYP51基因?qū)ι臣?xì)胞形成、成熟過程的調(diào)節(jié)以及對性腺質(zhì)量甚至體質(zhì)量的影響比對性腺指數(shù)較小的動物的影響更為突出。從多方面更深入細(xì)致地研究海膽CYP51基因的功能和作用機(jī)理,將是下一步研究的重點。

參考文獻(xiàn):

[1] Lepesheva G I,Waterman M R.CYP51-The omnipotent P450[J]. Molecular and Cellular Endocrinology,2004,215(1-2):165-170.

[2] Gibbons G F,Pullinger C R,Mitropoulos K A.Studies on the mechanism of lanosterol 14 alpha—demethylation[J].Biological Chemistry,1979,183(2):309-315.

[3] Trzaskos JM,Fischer R T,Favata M F.Mechanistic studies of lanosterol C-32 demethylation[J].Biological Chemistry,1986,261 (36):16937-16942.

[4] Trzaskos JM,Bowen W D,Shafiee A,et al.Cytochrome P-450-dependent oxidation of lanosterol in cholesterol biosynthesis[J]. Biological Chemistry,1984,259(22):13402-13412.

[5] Yoshida Y,Aoyama Y,Noshiro M,et al.Sterol14 alpha-demethylase P450(CYP51)provides a breakthrough for the discussion on the evolution of cytochrome P450 gene superfamily[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,273(3):799-804.

[6] Berriman M,Ghedin E,Hertz-Fowler C,et al.The genome of the African trypanosomeTrypanosomabrucei[J].Science,2005,309: 416-422.

[7] Lepesheva G I,Waterman M R.Sterol 14α-demethylase Cytochrome P450(CYP51),a P450 in allbiological kingdoms[J].Biochem Biophys Acta,2007,1770(3):467-477.

[8] 仇雪梅,李寧,鄧學(xué)梅,等.Ex-FABP作為雞腹脂性狀主要候選基因的研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2005,32(5):429-434.

[9] Wang Xiuli,Qiu Xuemei,Meng Xiangying.Preliminary study on polymorphism analysis of SpRunt-1 gene by PCR-SSCP inStrongylocentrotusintermediusand its association with growth traits [J].Mol Bio Rep,2010,37:411-415.

[10] 王鳳超.兔促減數(shù)分裂甾醇(MAS)合成酶及代謝酶Δ14-SR、CMO的分子全長克隆及表達(dá)調(diào)控分析[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2005:1-98.

[11] Schaller H.The role of sterols in plant growth and development [J].Progress in Lipid Research,2003,42(3):163-175.

[12] 楊嬌艷,廖明軍,楊劭.甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報,2008,24(10):1681-1688.

[13] Byskov AG,Andersen CY,Nordholm L,etal.Chemicalstructure of sterols that activate oocytemeiosis[J].Nature,1995,374:559-562.

[14] Grondahl C,Ottesen JL,lessl M,et al.Meiosis-activating sterol promotes resumption ofmeiosis in oocytes cultured in vitro in contrast to related oxysterols[J].Biology of Reproduction,1998,58: 1297-1302.

[15] 王超.羊毛甾醇14-α去甲基酶(CYP51)基因調(diào)節(jié)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟和血漿膽固醇代謝研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2006:1-135.

[16] Stromstedt M,Waterman M R,Haugen T B,et al.Elevated expression of lanosterol 14α-demethylase(CYP51)and the synthesis of oocytemeiosis-activating sterols in postmeiotic germ cell of male rats[J].Endocrinology,1998,139(5):2314-2321.

[17] Byskov A G,Andersen C Y,Leonardsen A,etal.Meiosis activating sterols(MAS)and fertility in mammals and man[J].J Exp Zool,1999,285:237-242.

Cloning and SNPs analysis of CYP51 gene cDNA in sea urchin Strongylocentrotus intermedius

QIU Xue-mei1,2,WU Ling-zhi2,GUO Xiao-li2,ZHANGWei-jie1,CONG Yu-ting2, CHANG Ya-qing1,2,SONG Jian1,2,LIU Yang2,WANG Xiu-li2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

In this study,CYP51 gene was cloned and its single nucleotide polymorphisms(SNPs)was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism(PCR-SSCP)in sea urchinStrongylocentrotusintermedius.The results showed that the 1 536 bp sequence including a 1 491 bp open reading frame(ORF)and encoding 496 amino acidswas obtained fromCYP51 gene.A SNP A→G was found in the 161st nucleotide of open reading frame inCYP51 cDNA.The analysis of the SNPs showed that there was a significant association(P＜0.05)between the SNP and growth traits such as gonad weight and body weight.TheCYP51 cDNA cloning and its SNPs analysiswas the first time conducted in sea urchinStrongylocentrotusintermedius.The findings provide basic theory ofmolecularmarker-assisted breeding of the sea urchin.

Strongylocentrotusintermedius;CYP51 gene;cloning;single nucleotide polymorphism(SNPs)

S917

A

2012-03-27

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目 (20102043);遼寧省 “百千萬人才工程”項目 (2010921093)

仇雪梅 (1964-),女,博士,教授。E-mail:xmqiu@dlou.edu.cn

2095-1388(2012)04-0294-06