常亞青封妮莎王軼南丁君劉志敏穆小虎

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

蝦夷馬糞海膽致病菌強壯弧菌的PCR檢測方法

常亞青,封妮莎,王軼南,丁君,劉志敏,穆小虎

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

強壯弧菌Vibriofortis是蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotusintermedius的一種致病菌。為建立強壯弧菌的PCR檢測方法,根據(jù)強壯弧菌gyrB基因的高度變異區(qū)序列設(shè)計引物,篩選出特異性強的3對引物VF-6、VF-7及VF-8,分別對強壯弧菌S0907及20株參比菌株進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果顯示,3對引物均對強壯弧菌擴增出與預(yù)期大小一致的目的基因片段且參考菌株無擴增條帶。以不同稀釋度的菌懸液制備的DNA模板進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果顯示,3對引物VF-6、VF-7及VF-8可檢測的最低細(xì)菌濃度分別為4.1×104、4.1× 103、4.1×102cfu/mL;對不同稀釋度的細(xì)菌DNA模板進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果顯示,3對引物VF-6、VF-7及VF-8可檢測的最低DNA含量分別為1.4、0.14、0.014 pg/μL。試驗結(jié)果表明:3對引物的特異性均較好,但靈敏度存在差異,其中以VF-8為引物的PCR檢測方法最佳;使用以VF-8為引物的PCR檢測方法對實驗室養(yǎng)殖海膽及其生境樣品進(jìn)行初步檢測,健康海膽、養(yǎng)殖海水及投喂的海帶均為陰性,而自然海域海水中帶有一定量的強壯弧菌。

蝦夷馬糞海膽;強壯弧菌;PCR檢測;gyrB基因

蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotusintermedius于1989年由大連海洋大學(xué)自日本引進(jìn)中國,目前已經(jīng)成為中國主要的海水養(yǎng)殖品種之一。隨著海膽?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展及養(yǎng)殖環(huán)境的污染,海膽也面臨著病害的威脅,如海膽的黑嘴病、紅斑病、禿海膽病等細(xì)菌性疾病及海膽變形蟲病等[1-4]。海膽細(xì)菌性疾病的主要病原菌多為弧菌[5-6],經(jīng)本課題組研究證實,強壯弧菌Vibriofortis是蝦夷馬糞海膽的一種致病菌[7]。此外,強壯弧菌還可導(dǎo)致虹鱒魚患病,也可使鹵蟲無節(jié)幼體死亡率達(dá)100%[8],但目前尚未見對其檢測方法的相關(guān)報道。

gyrB基因是普遍存在于細(xì)菌內(nèi)編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因,與rpoD、rpoB、groE等基因相比,gyrB基因?qū)ο嘟锓N具有很高的分辨率[9-11],在定量分析技術(shù)上可以彌補16S rDNA基因保守性過高[12]及DGGE圖譜中易對微生物多樣性造成假象[13]等一系列缺陷,因此,常用其作為區(qū)分親緣較近種的靶基因。目前,gyrB基因已應(yīng)用于多重PCR技術(shù)、PCR-ALFP技術(shù)等多種方法的研究中[14-15]。本研究中,作者基于gyrB基因結(jié)合PCR快速檢測技術(shù),根據(jù)強壯弧菌高度變異區(qū)序列設(shè)計引物,篩選出特異性強、靈敏度高的強壯弧菌VibriofortisPCR檢測方法引物,旨在為海膽的致病菌檢測、監(jiān)控等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

強壯弧菌S0907由大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室 (簡稱為本實驗室)提供,該菌分離自蝦夷馬糞海膽綜合疾病患病處[7]。參比菌株20株,包括:鰻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌與嗜水氣單胞菌等常見水產(chǎn)動物致病菌,黃海希瓦氏菌、燦爛弧菌、殺鮭氣單胞菌與河豚毒素假交替單胞菌等棘皮動物致病菌株,以及強壯弧菌參比菌株D14J223。各菌株名稱、編號及其來源詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組的提取 將細(xì)菌于2216E培養(yǎng)基上劃線分離,于28℃下培養(yǎng)18～24 h,挑取單菌落懸浮于無菌水中并稀釋至108cfu/mL,用細(xì)菌基因組提取試劑盒 (天根生物科技有限公司生產(chǎn))提取DNA模板。

表1 細(xì)菌菌株編號及來源Tab.1 Detail of the bacteria used in the experiment

1.2.2 引物設(shè)計 在GenBank上分別查找強壯弧菌及與其親緣關(guān)系相近的燦爛弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌等細(xì)菌的gyrB基因,利用Blast軟件進(jìn)行比對分析,選擇高度變異區(qū)序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物,由上海生工生物有限公司合成 (表2)。

表2 引物的序列及目的基因片段大小Tab.2 Sequences of primers and the sizes of am plified fragments

1.2.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系共25μL,包括MgCl2(25 mmol/L)1.5μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2.0μL,TaqDNA酶(250 U/μL)0.125μL,上、下游引物各1μL, DNA模板1μL,用ddH2O補至25μL。

PCR反應(yīng)程序:94℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性30 s,57℃下退火30 s,72℃下延伸1 min,共進(jìn)行35個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min,于4℃下保存。取PCR產(chǎn)物4μL,用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)寶生物工程 (大連)有限公司純化并測序。

1.2.4 特異性及靈敏度的檢驗 以強壯弧菌S0907以及20株參比菌株的DNA為模板,分別對其進(jìn)行PCR擴增。

將強壯弧菌懸浮于無菌水中并稀釋至 108cfu/mL,依次進(jìn)行10倍濃度的稀釋。用細(xì)菌基因組試劑盒分別提取不同濃度梯度細(xì)菌的DNA模板,每個PCR反應(yīng)體系中加1μL DNA模板進(jìn)行PCR擴增。用平板活菌計數(shù)法確定菌懸液的濃度。

對濃度為107cfu/mL的強壯弧菌DNA模板采用微量光度計定量,并依次進(jìn)行10倍濃度的稀釋,取各稀釋度DNA模板1μL為進(jìn)行PCR擴增。

1.2.5 海膽及環(huán)境樣品的檢測 從本實驗室養(yǎng)殖室隨機選擇4個蝦夷馬糞海膽?zhàn)B殖槽,分別取養(yǎng)殖海水1 L,并隨機選擇10枚健康海膽 (直徑為3～6 cm,體質(zhì)量為16～30 g)及投喂用海帶5 g。另從黑石礁自然海域取海水1 L及海帶20 g。

用一次性注射器分別抽取海膽體腔液1 mL,離心 (500×g,2 min,4℃)后取上清液;水樣經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾富集后使用1 mL無菌水沖洗收集;用無菌刀片刮取各養(yǎng)殖槽內(nèi)或自然海域海帶的表面黏液,混合后用無菌水稀釋至1 mL。將上述樣品分別于100℃水浴中煮沸10 min后快速冷卻,以12 000 r/min離心10 min,取上清作為DNA模板,分別按 “1.2.3”的PCR反應(yīng)及反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴增。以 “1.2.4”中制備的不同濃度的細(xì)菌DNA模板為對照。

2 結(jié)果

2.1 PCR引物特異性的檢驗

靈敏度檢測結(jié)果顯示,3對引物均對強壯弧菌擴增出與預(yù)計大小一致的DNA片段,其它參比菌株無特異條帶 (圖1)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序,用Blast軟件進(jìn)行比對分析,與強壯弧菌的相似性為99%。研究表明,3對引物均具有較好的特異性。

圖1 引物VF-6、VF-7和VF-8對強壯弧菌及參比菌株的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Result of PCR am p lification w ith primer VF-6,VF-7,and VF-8 for V.fortis and reference strains

2.2 PCR引物靈敏度的檢驗

經(jīng)活菌計數(shù)法計算,10個梯度的活菌濃度為4.1×10-1～4.1×108cfu/mL;經(jīng)微量光度計測定,10個梯度的細(xì)菌DNA濃度為1.4×10-2～1.4×103pg/μL。利用引物VF-6、VF-7、VF-8分別對不同細(xì)菌濃度及不同DNA濃度進(jìn)行PCR擴增。結(jié)果顯示,3對引物VF-6、VF-7、VF-8可檢測的最低細(xì)菌濃度分別為4.1×104、4.1×103、4.1×102cfu/mL,可檢測的最低 DNA含量分別為 1.4、0.14、0.014 pg/μL(圖2)。

圖2 引物VF-6、VF-7和VF-8對細(xì)菌濃度及DNA濃度靈敏度的擴增結(jié)果Fig.2 Sensitivity of PCR detection w ith primer VF-6,VF-7,and VF-8 for bacterial concentration and genome DNA concentration

2.3 對海膽體腔液及環(huán)境的檢測

利用引物VF-8分別對各樣品進(jìn)行強壯弧菌的PCR檢測,養(yǎng)殖健康海膽體腔液、實驗室海膽?zhàn)B殖海水、實驗室養(yǎng)殖環(huán)境海帶及黑石礁海域海帶均無擴增條帶,僅黑石礁海域海水?dāng)U增到濃度與103cfu/mL相近的特異片段 (圖3)。

圖3 引物VF-8對海膽及其環(huán)境樣品的PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amp lifications of samples from sea urchin and environment by primer VF-8

3 討論

病原菌的檢測方法除常規(guī)的生理生化鑒定技術(shù)外,還包括免疫學(xué)、PCR檢測方法及芯片檢測技術(shù)等[16-17]。與其他方法相比,PCR檢測方法具有簡便、快速、特異性強等優(yōu)點,近年來在多種病原菌的檢測中廣泛應(yīng)用。本研究中基于gyrB基因篩選到3對強壯弧菌特異性引物并建立了PCR檢測方法,可將強壯弧菌與常見水產(chǎn)動物致病弧菌、假單胞菌等以及其它棘皮動物致病菌區(qū)分開。

以引物VF-8建立的PCR快速檢測方法具有較高的靈敏度,可檢測的最低DNA含量為0.014 pg/μL,最低細(xì)菌濃度為4.1×102cfu/mL。相關(guān)研究中,基于16S rDNA基因建立的燦爛弧菌PCR檢測方法,可檢測的DNA最低含量為0.5 pg[18],利用toxR基因建立的溶藻弧菌PCR檢測方法,可檢測的DNA最底限為0.01 pg[19]。因此,從細(xì)菌檢測的最低DNA含量比較,本研究中建立的強壯弧菌檢測方法表現(xiàn)出更高的靈敏度。同時,本結(jié)果也反映出以gyrB基因為檢測目的片段具有一定的優(yōu)越性。與DNA檢測量相比,活菌檢測靈敏度在實踐應(yīng)用中更為直觀。同樣以gyrB基因為目的片段,應(yīng)用多重PCR方法檢測多種弧菌,其檢測范圍為4 ×104～2×103cfu/mL[20]。創(chuàng)傷弧菌的PCR檢測方法靈敏度為300 cfu/g[21],溶藻弧菌的實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度為102cfu/mL[22],與本研究中檢測方法的靈敏度相當(dāng)。

強壯弧菌為條件性致病菌,對蝦夷馬糞海膽的半致死濃度為105cfu/mL[7-8]。本研究中,在自然海域的海水中檢測出強壯弧菌量為103cfu/mL,而對養(yǎng)殖槽內(nèi)海水的檢測結(jié)果為陰性,即強壯弧菌含量低于4.1×102cfu/mL,并遠(yuǎn)小于強壯弧菌的半致死濃度。推測養(yǎng)殖用水經(jīng)沙濾等處理后細(xì)菌大大降低,僅在條件惡化時細(xì)菌才增殖,進(jìn)而導(dǎo)致海膽患病。本研究中,對養(yǎng)殖健康海膽與投喂海帶的檢測結(jié)果均為陰性,提示海膽生境可能沒有或僅存在極少量的強壯弧菌。另外,由于養(yǎng)殖中投喂的海帶取自自然海域,其有可能是致病菌傳播的媒介。但本研究結(jié)果顯示,雖然自然海域海水中存在一定量的強壯弧菌,但海帶所攜帶的強壯弧菌含量可能極微,至少低于檢測限,其是否與強壯弧菌的傳播有關(guān)仍需進(jìn)一步探討。

[1] 常亞青,丁君,宋堅,等.海參、海膽生物學(xué)研究與養(yǎng)殖[M].北京:海洋出版社,2004.

[2] 王斌,李巖,李霞,等.蝦夷馬糞海膽“紅斑病”病原弧菌特性及致病性[J].水產(chǎn)學(xué)報,2006,20(3):371-375.

[3] Maes P,Jangoux M.The bald-sea-urchin disease:a biopathological approach[J].Helgolander Meeresunters,1984:37:217-244.

[4] Miller R J.Succession in sea urchin and seaweed abundance in Nova Scotia[J].Canada Mar Bio1,1985,84:275-286.

[5] Takeuchi K,Tajima K,Iqbal M M,et al.Taxonomical and serological studies on the causative bacteria of the disease of sea urchinStronglocentrotusintermediusoccurring at low water temperature [J].Fisheries Science,1999,65(2):264-268.

[6] 王軼南,劉艷萍,常亞青.患病與健康蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)體腔液菌群的PCR-DGGE分析比較[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報,2011,13(1):111-116.

[7] Wang Y N,Feng N S,Li Q,et al.Isolation and characterization ofbacteria associated with a syndrome disease of sea urchinStrongylocentrotusintermediusin North China[J/OL].Aquaculture Research.DOI:10.1111/j.1365-2109.2011.03073.x.http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2109.2011.03073. x/abstract.

[8] Austin B,Austin D,Sutherland R,et al.Pathogenicity ofVibriosto rainbow trout(Oncorhynchusmykiss,Walvaum)andArtemianauplii[J].Environ Microbiol,2005(7):1488-1495.

[9] Kupfer M,Kuhnert P,Koeczak BM,et al.Genetic relationships ofAeromonasstrains inferred from 16S rRNA,gyrB,andrpoBgene sequences[J].Int JSyst Evol Micmbiol,2006(5):2743-2751.

[10] Volokhov D V,Neveriv A A,George J,et al.Genetic analysis of housekeeping genes ofmembers of the genusAcholeplasma:Phylogeny and complementary molecular markers to the 16S rRNA gene[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2007,44(2): 527-532.

[11] Chelo M I,Ze-Ze L,Tenreiro R,etal.Congruence of evolutionary relationships inside theLeuconostoc-Oenococcus-Weissella clade assessed by phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene,dnaA,gyrB,rpoC,anddnaK[J].Int JSyst EvoIMicr,2007,57:276-286.

[12] Wang L,Lee F,TaiC,et al.Comparison ofgyrBgene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in theBacillussubtilisgroup[J].Int JSyst Evol Micro,2007,57:1846-1850.

[13] Wang X,Haruta S,Wang P,etal.Diversity of a stable enrichment culture which is useful for silage inoculantand its succession in alfalfa silage[J].FEMSMicrobiol Ecol,2006,57:106-115.

[14] Higgins P G,Lehmann M,Wisplinghoff H,et al.GyrBMultiplex PCR to differentiate betweenAcinetobactercalcoaceticusandAcinetobactergenomic species 3[J].JClin Microbiol,2010,48(12): 4592-4594.

[15] Gulati PS,Virdi JS.The rrn locus andgyrBgenotyping confirm the existence of two clonal groups in strains ofYersiniaenterocoliticasubspeciesPalearcticabiovar1 A[J].Rea Microbiol,2007,158 (3):236-243.

[16] 李晨,黃倢,謝國駟,等.3種水產(chǎn)病原菌簡型基因芯片檢測技術(shù)的建立[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2011,41(3):37-42.

[17] 景宏麗,李強,吳秋仙,等.黃海希瓦氏菌單抗介導(dǎo)間接ELISA快速檢測技術(shù)的建立[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2010,25(6): 547-552.

[18] 張鳳萍,王印庚,李勝忠,等.應(yīng)用PCR方法檢測刺參腐皮綜合征病原燦爛弧菌[J].海洋水產(chǎn)科學(xué),2008,29(5):101-107.

[19] 韓一凡,莫照蘭,李杰,等.溶藻弧菌的PCR快速檢測方法[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2009,39(6):1237-1240.

[20] Chua K H,Thong K L.The simultaneous differential detection of human pathogenic and nonpathogenicVibriospecies using amultiplex PCR based ongyrBandpntAgenes[J].J Appl Microbiol, 2010,108(6):1940-1945.

[21] Kumai H S,Parvathi A,Karunasagar I,et al.AgyrB-based PCR for the detection ofVibriovulnificusand its application for direct detection of this pathogen in oyster enrichment broths[J].Int J Food Microbiol,2006,111(3):216-20.

[22] Zhou S,Hou Z,LiN,etal.Developmentof a SYBRGreen I realtime PCR for quantitative detection ofVibrioalginolyticusin seawater and seafood[J].Applied Microbiology,2007,103:1897-1906.

PCR detection of pathogen Vibrio fortis in sea urchin Strongylocentrotu intermedius

CHANG Ya-qing,FENG Ni-sha,WANG Yi-nan,DING Jun,LIU Zhi-min,MU Xiao-hu

(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Vibriofortisis a pathogenic bacteria of sea urchinStrongylocentrotusintermedius.To establish PCR detection process ofV.fortis,three pairs of primer VF-6,VF-7 and VF-8 were designed according to the specified region ofgyrBgenes ofV.fortis.20 strains of bacteria were included in PCR amplification as control.The results showed that the amplified fragments of PCR applied with the three pairs of primerwere all agreed with the expected sizes,and no PCR product was found from the other reference strains.Different dilutions of bacterial suspension were used as DNA templates in PCR amplification,the results showed that the three pairs of primer was found to detect theminimum bacterial concentration of 4.1×104,4.1×103,4.1×102cfu/mL respectively.Meanwhile,different dilutions of DNA were performed in PCR amplification,the results showed that theminimum detectable concentration of bacteria DNA was 1.4,0.14,0.014 pg/μL respectively.These experiments showed that all the three pairs of primers demonstrated excellent specificity toV.fortis.However,the sensitivity of the PCR amplifications was different among the three primers,PCR procedure applied with primer VF-8 showing the best.V.fortisin coelomic fluid of sea urchin and the environmental sampleswere detected by PCR detection method with VF-8.The results of healthy sea urchin,breeding seawater and feeding kelp were negative,while the sample of seawater from natural sea area had a certain amount ofV.fortis.

Strongylocentrotusintermedius;Vibriofortis;PCR detection;gyrBgene

S947.9

A

2012-04-25

國家自然科學(xué)基金資助項目 (30972269);遼寧省 “百千萬人才工程”資助項目 (2008921059);國家海洋局海洋公益項目(201105007)

常亞青 (1967-),教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:yqchang@dlou.edu.cn

2095-1388(2012)04-0289-05