李加友 蔡麗陽 于建興 沈 潔 陸筑鳳

(1.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001；2.嘉興市知味軒飼料有限公司，浙江嘉興 314001)

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）作為 GRAS（Generally regarded as safe）生物可用于食品和藥品行業(yè)，用于食用蛋白和谷胱甘肽等產(chǎn)品的生產(chǎn)[1]。德國、美國等一些國家和地區(qū)廣泛地將產(chǎn)朊假絲酵母用于飼料行業(yè)，作為優(yōu)良的飼用蛋白質(zhì)；或者用于秸稈、菜籽餅等材料的發(fā)酵，用于飼用蛋白的生產(chǎn)或脫毒[2-3]。產(chǎn)朊假絲酵母具有較強的轉(zhuǎn)化無機氮為有機氮的能力，并且在其發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的生物活性物質(zhì)，因此，利用產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)飼用添加劑或發(fā)酵劑具有良好的應(yīng)用前景。

利用單因素比較試驗和響應(yīng)面分析的方法對產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為產(chǎn)朊假絲酵母在發(fā)酵飼料和富硒飼料產(chǎn)品開發(fā)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[4-5]。

1 材料與方法

1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis），本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基和菌種保藏培養(yǎng)基。

麥芽汁培養(yǎng)基：稱取150 g麥芽，用600 ml水在65℃水浴鍋中糖化4 h。將糖化液用4～6層紗布過濾，將濾液放置在冰箱中靜置過夜。去沉淀后收集上清液，調(diào)整其波美度至 12оBe'，121 ℃滅菌 20 min，pH值自然。固體培養(yǎng)基另加1.5%的瓊脂。

發(fā)酵出發(fā)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/l、蛋白胨15 g/l、K2HPO41.0 g/l、MgSO41.0 g/l，pH 值 5.0。

1.3 試劑和藥品

蛋白胨和酵母膏為生化試劑，葡萄糖等其他化學(xué)試劑為分析純。

1.4 儀器設(shè)備

DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)）、FA1104N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、UV754紫外可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、Qyc-211全溫空氣搖床（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司生產(chǎn)）。

1.5 方法

1.5.1 培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

利用單因素比較的方法對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)發(fā)酵出發(fā)培養(yǎng)基，在單因素優(yōu)化試驗中，只改變其中一個待測因素，而其他條件保持不變。

1.5.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗確定的主要影響因素，利用Box-Behnken組合設(shè)計的方法對其進(jìn)行試驗，然后利用響應(yīng)面分析方法對結(jié)果進(jìn)行回歸模擬，確定最優(yōu)培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)條件的單因素試驗

2.1.1 碳源對酵母菌生長的影響(見圖1)

圖1 碳源對酵母菌生長的影響

酵母生長過程中需要添加適量的速效碳源，以利于菌體對環(huán)境的快速適應(yīng)而縮短延滯期。由圖1可知，當(dāng)葡萄糖和蔗糖濃度均為20 g/l時，酵母的生物量達(dá)到最大值，但葡萄糖對菌體生長的促進(jìn)作用明顯較蔗糖要顯著得多。酵母菌對葡萄糖的利用要更容易且更有效，但進(jìn)一步增加葡萄糖濃度對酵母的生長有一定程度的抑制作用，可能的原因是高濃度葡萄糖在前期促進(jìn)酵母菌快速生長后，導(dǎo)致體系中溶氧不足，反而對菌體的生長產(chǎn)生了抑制作用，也有可能是過多的葡萄糖代謝后會產(chǎn)生有機酸，導(dǎo)致體系pH值下降，不利于酵母菌的生長。因此，選用葡萄糖為酵母菌生長的碳源，且適宜濃度為20 g/l。

2.1.2 氮源對酵母菌生長的影響(見圖2、圖3)

圖2 無機氮源對酵母菌生長的影響

圖3 有機氮源對酵母菌生長的影響

酵母生長時需要添加一定量的氮源，通常合適的氮源對酵母菌的生長產(chǎn)生決定性的影響。試驗結(jié)果表明，無機氮源中硝酸銨對酵母菌的生長較有利，可能的原因是硝酸銨可以被酵母菌完全利用，而硫酸銨和氯化銨中的NH4+被利用后，發(fā)酵液中較高濃度的SO42-和Cl-對酵母菌的生長有一定的毒性。在以酵母膏和蛋白胨為氮源的酵母發(fā)酵過程中，酵母膏對產(chǎn)朊假絲酵母的生長有較好的促進(jìn)作用。從圖2和圖3的比較可以看出，在酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)中，無機氮源較有機氮源的效果要差，因此，選用酵母膏為產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)的氮源。

2.1.3 無機鹽對酵母菌生長的影響(見圖4)

圖4 無機鹽對酵母菌生長的影響

無機鹽是微生物生長的必需營養(yǎng)成分，因此，在實際發(fā)酵過程中，需要考察不同無機鹽對微生物生長的影響。通過比較K2HPO4、MgSO4、CaSO4、NaCl 和MnSO4等幾種常見和常量無機鹽對酵母菌生長的影響，選擇對酵母菌影響較為顯著的無機鹽用于進(jìn)一步的優(yōu)化試驗。結(jié)果表明，K2HPO4和MgSO4對酵母菌生長的影響較其他因素顯著，當(dāng)MgSO4用量為1 g/l時，酵母菌的OD600達(dá)到了1.63，而當(dāng)K2HPO4的用量為1.25 g/l時，酵母菌的OD600達(dá)到最大值，進(jìn)一步增加他們的濃度，酵母菌生物量并不再顯著增加。在所考察的無機鹽中，K2HPO4、MgSO4對酵母菌生長影響較顯著，而且在試驗中發(fā)現(xiàn)，加入K2HPO4、MgSO4兩種無機鹽，對酵母菌的生長更為有利，因此，在響應(yīng)面分析中，選擇這兩種無機鹽用于優(yōu)化試驗。

2.1.4 pH值對酵母菌生長的影響(見圖5)

圖5 不同pH值下的產(chǎn)朊假絲酵母生長情況

試驗結(jié)果表明，產(chǎn)朊假絲酵母的最適生長pH值為5.5。不同pH值對培養(yǎng)基中各組分的解離、菌體細(xì)胞外周帶電性質(zhì)等都會產(chǎn)生相應(yīng)影響，也會影響胞內(nèi)酶的催化活性，從而進(jìn)一步影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和生長，因此，選擇合適的pH值對酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)具有重要意義。

2.1.5 溫度對酵母菌生長的影響(見圖6)

圖6 不同溫度下的產(chǎn)朊假絲酵母的生長曲線

由圖6可知，在25℃和28℃時，酵母菌的生長情況相似，28℃時酵母菌的生物量稍高于25℃時的生物量，到28 h時生物量達(dá)到最大，此后生物量保持相對穩(wěn)定至48 h。當(dāng)培養(yǎng)溫度為31℃時，酵母菌的快速增殖期較25℃和28℃時稍晚一點，但其最大生物量相當(dāng)，不過，隨著發(fā)酵時間的延長，31℃時的生物量下降明顯，可能是溫度過高不利于酵母菌的生長。在培養(yǎng)溫度為34℃和37℃時，酵母菌的生長明顯受到抑制，表現(xiàn)為快速增殖期來得更晚，且最大生物量較低溫時要小；隨著發(fā)酵時間的延長，酵母菌生物量顯著下降，即高溫時酵母菌的衰亡期也提前了，穩(wěn)定時間變短。因此，酵母菌不利于在較高的溫度條件下培養(yǎng)，以28℃時生長最好。

2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果比較，葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和酵母膏對酵母菌的生長有顯著影響，但由于以上各因素存在一定程度的交互影響，因此選擇此4個因素作為考察的4個變量，用Design-Expert 7.0軟件對以上4個變量進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計（見表1），以發(fā)酵體系的OD600為響應(yīng)值對處理進(jìn)行響應(yīng)面分析（見表2）。利用軟件對不同處理方法產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行分析后建立二次響應(yīng)面回歸模型，并根據(jù)擬合的回歸方程得出最優(yōu)工藝參數(shù)，確定最優(yōu)響應(yīng)因子水平。

表1 Box-Behnken設(shè)計中各因素水平

本試驗采用Box-Behnken設(shè)計法，在培養(yǎng)溫度為28℃條件下，對酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，OD600的測定結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗的OD值測定結(jié)果

通過Design Expert7.0軟件對優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，獲得OD600對葡萄糖、酵母膏、K2HPO4和MgSO4等4種營養(yǎng)組分的二次多項式回歸方程：

二次響應(yīng)面分析模型的各因子在模型中的顯著水平如表3所示。當(dāng)置信度為95%時，即“Prob＞F”小于0.05，模型以及模型中的B、C、D因子、A因子的二次項、B因子的二次項和D因子的二次項等均顯著，且各因素對響應(yīng)值的影響效果依次為酵母膏＞K2HPO4＞MgSO4＞葡萄糖。所考察的各因素之間均不表現(xiàn)出明顯的交互作用，可能的原因是葡萄糖作為碳源和能源物質(zhì)，酵母膏含有氮源和生長因子等，而K2HPO4和MgSO4分別滿足菌體生長對鉀、鎂、磷、硫等元素的需要。因此，各因子在產(chǎn)朊假絲酵母生長過程中所起的營養(yǎng)作用不同，交互影響并不顯著。

根據(jù)此二項式可以求得當(dāng)OD600值最高時（最高值為1.782）葡萄糖的濃度為19.86 g/l，酵母膏濃度為9.56 g/l，K2HPO4濃度為 1.45 g/l，MgSO4濃度為 1.12 g/l。利用以上優(yōu)化后所得的參數(shù)值進(jìn)行驗證，共重復(fù)3次，得酵母菌發(fā)酵液OD600平均值為1.911，為預(yù)測值的107.2%，說明模型具有良好的重現(xiàn)性。

表3 響應(yīng)面試驗的方差分析

本試驗根據(jù)二次多項模型并利用Design Expert7.0軟件繪制出響應(yīng)面分析圖（見圖7)，每個響應(yīng)面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時其他2個變量保持在0（編碼為0）水平。

圖7 各因素相互作用的響應(yīng)面分析3D和等高線圖

3 結(jié)論

利用單因素試驗和響應(yīng)面分析結(jié)合的方法，獲得產(chǎn)朊假絲酵母的最優(yōu)發(fā)酵條件為：葡萄糖的濃度為19.86 g/l、酵母膏濃度為 9.56 g/l、K2HPO4濃度為 1.45 g/l、MgSO4濃度為1.12 g/l，pH值5，溫度28℃。

[1]何東東,張坤生.高產(chǎn)食用蛋白質(zhì)產(chǎn)朊假絲酵母的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品科學(xué),2009,30(21):210-213.

[2]李亞蕾,楊波,羅瑞明.以綠色木霉Trichoderma viride NUA-051及產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilis發(fā)酵酸解玉米秸稈生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的工藝研究[J].食品科技,2006(7):261-264.

[3]吳遠(yuǎn)根,王廣莉,詹深山,等.產(chǎn)朊假絲酵母改善麻瘋樹提油餅粕營養(yǎng)效價的研究[J].飼料工業(yè),2009,30(18):35-39.

[4]Michal Dabros,Moira Monika Schuler,Ian W Marison.Simple control of specific growth rate in biotechnological fed-batch processes based on enhanced online measurements of biomass[J].Bioprocess Biosyst.Eng.,2010,33:1109-1118.

[5]牛海濤,湯燕花.利用產(chǎn)朊假絲酵母轉(zhuǎn)化無機硒為有機硒的研究[J].飼料工業(yè),2006,27(20):16-18.