馬開峰 張志毅 王斯琪 宋躍朋 張德強

(林木育種國家工程實驗室(北京林業(yè)大學)，北京，100083)

DNA甲基化是基因組的一種主要的表觀遺傳修飾形式，指由Dnmt催化并以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體發(fā)生催化反應，產(chǎn)生N-甲基腺嘌呤、N-甲基胞嘧啶和C-甲基胞嘧啶的現(xiàn)象［1］。在真核生物中，DNA甲基化主要以5-甲基胞嘧啶的形式存在［2-3］。正常情況下，植物基因組DNA中約20%～30%的胞嘧啶殘基發(fā)生甲基化，其中絕大部分的甲基化位于CpG二核苷酸和CpNpG三核苷酸對中［4-7］，并在植物基因表達調(diào)控、外源基因防御、個別基因表達模式的遺傳等途徑中起著重要的作用［8-9］。 Methylation-sensitive Amplified Polymorphism(MSAP)是在AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子標記技術(shù)，操作相對簡便，同時不需知道被檢測DNA的序列信息，即可在全基因組范圍檢測5’-CCGG位點的胞嘧啶甲基化變化，在不同生物上具有通用性［10-22］。該技術(shù)作為檢測胞嘧啶甲基化的手段始見于Reyna-López等［10］檢測二形真菌基因組 DNA甲基化，之后被廣泛用于玉米［11-12］、水稻［13-14］、棉花［15-16］、油菜［17］等作物中。在林木中，研究者利用該技術(shù)對落葉松［18］、蘋果［19］、甜桔栽培種［20］、紅樹［21］、杉木［22］等樹種基因組 DNA 甲基化進行了研究，并認為基因組甲基化與林木體胚發(fā)生、生物量及雜種優(yōu)勢密切相關(guān)。

毛白楊(Populus tomentosa Carr.)是我國特有白楊派樹種，它分布廣，速生，適應性和抗性強，材質(zhì)優(yōu)良，是華北平原營造人工豐產(chǎn)林和農(nóng)田防護林的重要樹種［23］。因此，在表觀遺傳學領(lǐng)域?qū)ζ溥M行研究具有重要意義，但目前研究毛白楊基因組DNA甲基化的實例尚未見報道。本實驗首次將MSAP技術(shù)應用于毛白楊，通過優(yōu)化選擇性擴增體系，對毛白楊及其種內(nèi)雜交子代的CCGG甲基化相對水平、甲基化模式的遺傳變異進行分析，為進一步研究毛白楊基因組DNA甲基化與表型性狀的相關(guān)性及雜種優(yōu)勢形成機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2008年1月分別從陜西楊凌職業(yè)技術(shù)學院、山東省國營冠縣苗圃采集毛白楊P.tomentosa-1(Pt-1，♀)、P.tomentosa-2(Pt-2，♂)花枝運至北京林業(yè)大學溫室進行水培雜交，獲得毛白楊種內(nèi)雜交子代P×tomentosa-151幼苗植株栽植于北京林業(yè)大學溫室。2010年1月份采集Pt-1、Pt-2、P×tomentosa-151根段進行沙埋，獲取幼化［24-25］后的植株，并將幼株種植于盛滿營養(yǎng)豐富的基質(zhì)土壤(V沙土∶V珍珠巖∶V蛭石∶V草炭=2 ∶1 ∶1 ∶1)的圓形花盆(內(nèi)徑38 cm，高30 cm)中，放置于北京林業(yè)大學溫室使其生長。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取

2010年8月20 日同時采集上述幼化方法所得親本 Pt-1(株高0.58 m，地徑7.08 mm)、Pt-2(株高0.76 m，地徑7.93 mm)及子代 P×tomentosa-151(株高0.84 m，地徑8.23 mm)幼株莖端第3～4片功能葉，迅速放入液氮中冷凍處理，采用CTAB法提取全基因組DNA并利用NanoVueTM紫外/可見光分光光度計(GE Healthcare Company)檢測，后置于冰箱中-20℃保存。

1.2.2 基因組酶切—連接與預擴增

利用對甲基化敏感的同裂酶Hpa II/Msp I(Promega公司生產(chǎn))分別與限制性內(nèi)切酶Eco RI(Promega公司生產(chǎn))組合對材料基因組DNA進行雙酶切和連接。Eco RI接頭：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，5’-AATTGGTACGCAGTC-3’;Hpa II/Msp I接頭：5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’，5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’。預擴增引物：Eco RI+A 5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’;Hpa II/Msp I+0 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’。

20μL預擴增反應體系(1×buffer)包括去離子水，3μL 酶切—連接產(chǎn)物，0.3 mmol/L 各 dNTP，E+A引物和H/M+0引物(序列見表1)各0.03 nmol，5 U Taq酶。94℃變性2 min，按以下參數(shù)擴增30個循環(huán)，94℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃80 s，最后72 ℃延伸5 min。

表1 接頭及擴增引物序列

1.2.3 選擇性擴增

反應體系(1×buffer)總體積為20μL，其中引物E+A+2和H/M+3(序列見表1)、dNTP、Taq酶加入的量、預擴增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)5因素按照L16(45)正交試驗設(shè)計(表2)完成，稀釋后的預擴增產(chǎn)物加入量為4μL。94℃變性2 min，按下列參數(shù)進行PCR擴增：第一個循環(huán)擴增參數(shù)為94℃30 s，65℃30 s，72℃80 s，以后將每個循環(huán)的復性溫度遞減0.7℃，共擴增12個循環(huán);最后按下列參數(shù)擴增23個循環(huán)，94℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃80 s。

1.2.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染

選擇性擴增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，至電泳指示劑(約100 bp)接近凝膠底部時停止，銀染顯影［13］。

1.2.5 譜帶品質(zhì)的主觀評價與統(tǒng)計分析

將凝膠上顯示的各泳道譜帶品質(zhì)分為5等級，第1等級為譜帶粗細均勻，清晰可辨，無明顯拖尾現(xiàn)象，記為“4”;第2等級為譜帶粗細均勻，清晰可辨，有拖尾，記為“3”;第3等級為譜帶粗細均勻，但稍有模糊，記為“2”;第4等級為譜帶粗細相對均勻，但時有時無，模糊不可完全辨別，記為“1”;第5等級為譜帶不可辨認或無帶，記為“0”。以上記錄數(shù)據(jù)經(jīng)平方根轉(zhuǎn)換后用于計算。

表2 選擇性擴增體系因素及水平數(shù)

統(tǒng)計銀染譜帶時，對于不同材料或不同酶切處理在同一位點有帶時記為“1”，無帶時記為“0”。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計運算在 Excel2003、SPSS13.0軟件環(huán)境下進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSAP 體系優(yōu)化

2.1.1 基因組酶切—連接與預擴增

利用親本基因組進行體系優(yōu)化。MSAP是基于AFLP技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的標記方法，在PCR過程中需要高質(zhì)量的DNA模板。因此實驗對提取的基因組DNA質(zhì)量進行了檢測，NanoVueTM紫外/可見光分光光度計(GE Healthcare Company)檢測顯示，OD260nm/OD280nm值為 1.82～1.84，質(zhì)量濃度為230～246 ng/μL。瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖1A。利用Eco RI+Hpa II、Eco RI+Msp I組合分別對基因組DNA進行雙酶切，為減少酶切、接頭連接操作過程中DNA的損失，將酶切—連接在一步實驗操作中完成，瓊脂糖檢測見圖1B。

預擴增是MSAP標記的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，擴增產(chǎn)物質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系到選擇性擴增的成功與否。結(jié)果表明，300～500 ng范圍的基因組DNA經(jīng)酶切-連接后取3μL用于PCR，可得到質(zhì)量較好的預擴增產(chǎn)物(圖1C)。

2.1.2 選擇性擴增

用引物 III-c、引物 IV-d、引物 V-e、引物 VI-f、引物VII-g5對引物對Pt-1、Pt-2的預擴增產(chǎn)擴物進行選擇性擴增，銀染譜帶(圖2)品質(zhì)的主觀評價是利用兩次獨立實驗數(shù)據(jù)之和進行的(表3)。方差分析(表4)表明不同引物、dNTP、Tag酶濃度及預擴增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)對變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染譜帶品質(zhì)的影響具有顯著性差異，其中H/M+3引物濃度的影響最大，其次為E+A+2引物濃度。多重比較A4B4C1D3(4)E3為最優(yōu)組合，即引物H/M+3、引物E+A+2、dNTP、Taq酶、預擴增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)分別為0.03 nmol、0.03 nmol、0.2 mmol/L、1 U(或 1.5 U)、40倍時，20μL反應體系(1×buffer)經(jīng)PCR擴增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后產(chǎn)生的銀染譜帶品質(zhì)最佳。

2.2 毛白楊親子代間DNA甲基化分析

2.2.1 毛白楊CCGG胞嘧啶甲基化模式及親子代間甲基化狀態(tài)

將引物H/M+3、E+A+2配對組合而成的80對隨機選擇性擴增引物用于優(yōu)化后的MSAP反應體系，對毛白楊Pt-1、Pt-2及其種內(nèi)雜交子代P×tomentosa-151的CCGG位點進行標記，參照 Zhao X X［12］、Xiong L Z［13］、Fang J G［20］等的方法將毛白楊的CCGG胞嘧啶狀態(tài)分為4種：非甲基化狀態(tài)(帶型(1，1))、外側(cè)胞嘧啶半甲基化模式(CNG甲基化，帶型為(1，0))、內(nèi)側(cè)胞嘧啶完全甲基化模式(CG甲基化，帶型為(0，1))、不可確定CCGG甲基化模式或不可確定是否為CCGG位點(CG/CNG甲基化，帶型為(0，0))。

表3 L16(45)正交試驗設(shè)計譜帶品質(zhì)多重比較

圖2 選擇性擴增產(chǎn)物變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

實驗共篩選出32對具有良好擴增多態(tài)性的引物，檢測到6種類型63種狀態(tài)2314條譜帶(表5)，其中：A型，親子代間CCGG甲基化狀態(tài)保持完全一致的譜帶為191條(占8.25%);B型，子代的CCGG胞嘧啶甲基化程度比父母本均高的譜帶為100條(占4.32%);C型，子代的CCGG胞嘧啶甲基化程度比親本均低，或低于親本之一的譜帶為328條(占14.17%);D型，子代的CCGG位點胞嘧啶發(fā)生超甲基化的譜帶為308條(占13.31%);E型，親本中有甲基化發(fā)生，子代的CCGG胞嘧啶完全去甲基化的譜帶共397條(占17.16%);F型，親本與子代CCGG位點胞嘧啶均非甲基化的譜帶990條(占42.78%)。

表4 L16(45)正交試驗設(shè)計譜帶品質(zhì)方差分析

表5 毛白楊親子代間CCGG胞嘧啶甲基化譜帶類型及位點數(shù)

表5 (續(xù))

2.2.2 毛白楊親本及子代的CCGG甲基化相對水平

毛白楊Pt-1、Pt-2及其子代P×tomentosa-151的CCGG位點非甲基化相對水平約為56.83%～59.94%，總甲基化相對水平約為26.75%～29.39%，其中CG甲基化相對水平為14.65%～15.56%，高于CNG甲基化 12.10%～13.83%的相對水平。CG/CNG甲基化相對水平為13.31%～15.43%，介于CG甲基化、CNG甲基化相對水平之間(圖3)。可以看出，毛白楊的CCGG甲基化相對水平低于非甲基化相對水平，CG甲基化相對水平高于CNG甲基化相對水平。由圖3可知，母本的CCGG非甲基化相對水平高于父本的非甲基化相對水平，而母本的CCGG甲基化相對水平低于父本的CCGG甲基化相對水平。子代P×tomentosa-151的CCGG非甲基化相對水平高于親本的非甲基化相對水平，而其甲基化相對水平則低于親本的甲基化相對水平。其中子代CNG甲基化相對水平為12.10%，低于親本12.27%、13.83%的相對水平;子代CG甲基化相對水平為14.65%，低于親本15.30%、15.56%的相對水平;子代CG/CNG甲基化相對水平為13.31%，低于親本15.43%、13.79%的相對水平。

2.2.3 毛白楊親子代間CCGG胞嘧啶甲基化模式的遺傳變異

CCGG非甲基化位點的遺傳可分為3種(表6)：ID1指子代非甲基化位點來源于母本，非父本;ID2指子代非甲基化位點來源于父本，非母本;IE指非甲基化的CCGG位點來源于父本或母本，與親本保持完全一致。ID1與ID2兩種遺傳模式位點數(shù)分別為 123(占5.32%)、128(占 5.53%)，兩者之比為1 ∶1(χ2=0.100(1)=3.841)。

圖3 毛白楊親本與子代CCGG甲基化相對水平

CCGG胞嘧啶甲基化模式的遺傳可表現(xiàn)為8種(表6)：IA1指CG甲基化位點來自于母本，非父本;IA2指CNG甲基化來源于母本，非父本;IA3指CG/CNG甲基化位點來源于母本，非父本;IB1指CG甲基化位點來自于父本，非母本;IB2指CNG甲基化位點來源于父本，非母本;IB3指CG/CNG甲基化位點來源于父本，非母本;IC1指CG甲基化位點來源于父本或母本;IC2指CNG甲基化位點來源于父本或母本。結(jié)果顯示，子代中共有547個CCGG甲基化位點(占23.64%)遺傳自親本，其中遺傳自親本的CG甲基化位點數(shù)為213(占9.20%)，高于遺傳自親本的CNG甲基化位點數(shù)148(占6.40%)，而遺傳自親本的CG/CNG甲基化位點數(shù)為186(占8.04%)，介于CG、CNG甲基化位點數(shù)之間。子代中來源于母本的CCGG甲基化位點總數(shù)為155(占6.70%)，來自于父本的CCGG甲基化位點數(shù)為201(占8.69%)，可見子代中遺傳自父本的甲基化位點數(shù)高于遺傳自母本的甲基化位點數(shù)。

CCGG胞嘧啶甲基化模式的變異可分為7種，總數(shù)為2314(表6)：VA1為親本或親本之一發(fā)生甲基化，子代中產(chǎn)生新的CG甲基化位點;VA2為親本均無甲基化，子代中產(chǎn)生全新的CG甲基化位點;VB1指親本或親本之一發(fā)生甲基化，子代中產(chǎn)生新的CNG甲基化位點;VB2為親本均無甲基化，子代中產(chǎn)生全新的CNG甲基化位點;VC1為親本或親本之一發(fā)生甲基化，子代中產(chǎn)生新的CG/CNG甲基化位點;VC2為親本均無甲基化，子代中產(chǎn)生全新的CG/CNG甲基化位點;VD指親本或親本之一發(fā)生甲基化，而子代完全去甲基化，出現(xiàn)(1，1)帶型。經(jīng)檢測，子代中有526個CCGG位點的胞嘧啶甲基化模式發(fā)生了變異，所占比例為22.73%。子代CCGG胞嘧啶甲基化模式變異產(chǎn)生的全新甲基化位點數(shù)(CG、CNG、CG/CNG甲基化位點數(shù)之和)與完全去甲基化位點數(shù)分別為88(占3.80%)、146(占6.31%)，兩者之比接近 1 ∶2(χ2=1.923(1)=3.841)。子代中產(chǎn)生的CG甲基化變異位點數(shù)與CNG甲基化變異位點數(shù)分別為126(占5.45%)、122(占5.27%)，兩者之比為 1 ∶1(χ2=0.065(1)=3.841)。

實驗統(tǒng)計結(jié)果同時表明：子代P×tomentosa-151的CCGG胞嘧啶甲基化模式發(fā)生遺傳變異的位點數(shù)分別為547(占 23.64%)、526(占22.73%)，兩者之比為 1 ∶1(χ2=0.411(1)=3.841)。

表6 毛白楊親子代間CCGG胞嘧啶甲基化模式的遺傳變異

3 討論

3.1 毛白楊親本與子代甲基化相對水平

本實驗中由于基因組 DNA經(jīng) Eco RI+Hpa II、Eco RI+Msp I酶切后產(chǎn)生不同的帶型，若產(chǎn)生(1，1)譜帶，標記為非甲基化位點，若親子代同時產(chǎn)生(0，0)類型，實驗則無法識別，可能會造成甲基化位點統(tǒng)計量比實際甲基化位點數(shù)低的現(xiàn)象，有研究者認為該種狀況發(fā)生頻率較低［14-15］。因此，本文所涉及的甲基化水平均為可檢測的甲基化位點的相對水平。實驗表明，毛白楊親本及子代的CCGG甲基化相對水平均低于非甲基化相對水平，CNG甲基化相對水平均低于CG甲基化相對水平。同時本文將親本、子代甲基化相對水平進行了比較，認為子代的非甲基化CCGG位點的相對水平高于親本的相對水平，CG、CNG、CG/CNG甲基化相對水平均低于親本的相對水平。

DNA甲基化是已知的最早被發(fā)現(xiàn)的與基因抑制相關(guān)的表觀遺傳機制［26］，那么不同的甲基化模式或水平則可能影響某些基因的表達調(diào)控。Kovarik研究基因CG和CNG的甲基化水平的結(jié)果表明所有物種的CG甲基化水平都較高，CNG甲基化水平則因物種而異［27］，即甲基化模式與基因型可能具有相關(guān)性［20］。玉米基因組DNA甲基化過程中CNG甲基化相對水平低于CG甲基化相對水平［12］，雜種DNA甲基化程度低于親本，并且其甲基化程度與基因表達活性之間存在負相關(guān)［11］。Hauben等研究表明，油菜產(chǎn)量與 DNA甲基化水平呈負相關(guān)［17］。Zhao Y等則認為棉花子代甲基化水平比親本低，但也有個別略微升高現(xiàn)象的存在［16］。在林木中，泡桐叢枝病的發(fā)生被認為與DNA甲基化水平的降低有關(guān)［28］。杉木雜交組合植株的CNG甲基化以及CG甲基化程度均低于自交組合，基因組甲基化程度越低雜種優(yōu)勢越明顯，尤其是CNG甲基化與雜種優(yōu)勢呈顯著性負相關(guān)［22］。然而黑楊中的研究則顯示，在水分充足條件下，黑楊生長量與甲基化水平成正相關(guān);在干旱脅迫下，DNA甲基化有可能參與生物體的生理調(diào)控［29］。本文試驗材料，親本株高與地徑均小于子代，而其甲基化水平則高于子代。由于試驗材料數(shù)量限制，該結(jié)論需要在群體中進行檢驗。

3.2 毛白楊子代甲基化模式的遺傳變異

Holliday和Pogh于1975年做出CpG的甲基化和非甲基化模式能夠在細胞分裂中可以像DNA序列本身一樣被保留復制，也即在DNA復制完成時來自親本的DNA鏈繼續(xù)維持其被修飾的胞嘧啶模式的推論［30］。Bird 和 Southern［31］利用可以切割胞嘧啶非甲基化的CpG位點而不能切割胞嘧啶甲基化的CpG位點的酶，切割非洲爪蟾(Xenopus laevis)核糖體RNA基因非甲基化和甲基化位點并繪制出其模式圖，認為在一條特定的DNA鏈上，大部分CpG是甲基化的，非甲基化位點隨機出現(xiàn)，重要的是兩條鏈對應的CpG位點要么全部甲基化，要么全部非甲基化，驗證了Holliday等的推論。植物中大量研究表明，甲基化狀態(tài)常?？梢酝ㄟ^減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代［32-33］，另有一部分發(fā)生變異，同時存在動態(tài)變化和組織特異性表達，即植物不同發(fā)育時期、不同組織、甚至在不同環(huán)境中DNA甲基化模式也不盡一致［12-14，16-17，20，28］。如天然分布于河畔與鹽水沼澤的紅樹林，DNA甲基化的變異遠大于基因型的差異［21］。本文以幼化［24-25］處理后的木本植物毛白楊親本及子代同一時期、相同部位的葉片為材料，最大程度地消除親本與子代間年齡效應、組織特異性等帶來的誤差，利用MSAP標記檢測并分析了CCGG位點胞嘧啶甲基化模式的遺傳變異，認為子代中發(fā)生遺傳變異的位點數(shù)之比為1∶1。遺傳自父本的甲基化位點數(shù)高于遺傳自母本的位點數(shù)，可能與父本甲基化相對水平高有關(guān)，遺傳自親本的CG甲基化位點數(shù)高于遺傳自親本的CNG甲基化位點數(shù)。子代甲基化位點變異中產(chǎn)生的全新甲基化位點數(shù)與完全去甲基化位點數(shù)之比為1∶2，發(fā)生CG甲基化變異的位點數(shù)與發(fā)生CNG甲基化變異的位點數(shù)比例為1∶1?？梢娮哟鶳×tomentosa-151的CCGG甲基化狀態(tài)存在較大的變異，并且以去甲基化為主。Xiong L Z等［13］在研究親本與其雜種子代的DNA甲基化差異對水稻雜種優(yōu)勢的影響時認為，特異位點上的甲基化的改變對雜種優(yōu)勢有顯著效應。杉木子代中CCGG甲基化變異具有父母本效應，并且多發(fā)生在CG甲基化位點，可能與其雜種優(yōu)勢相關(guān)［22］?；谏鲜鼋Y(jié)論，本文初步推測毛白楊雜種優(yōu)勢的形成可能與DNA甲基化相對水平的降低或特異性位點的去甲基化相關(guān)，并認為研究毛白楊親本與子代群體間DNA甲基化水平、遺傳變異模式可能會進一步揭示毛白楊雜種優(yōu)勢形成的分子機制。

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