李一經(jīng)，吳 昱，唐麗杰，葛俊偉，喬薪瑗，崔 文，姜艷平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

IFN-γ為II型干擾素或免疫干擾素，主要由活化T淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生，是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的分泌性蛋白，相對于IFN-α和IFN-β，IFN-γ相關(guān)研究較少。Hiummler等率先開始犬IFN-α基因的研究[1]，隨后Devos等克隆了犬IFN-γ基因[2]，夏春、汪明等也克隆過德國牧羊犬和拉布拉多犬IFN-α基因序列[3]。2002年楊琪等克隆了犬IFN-γ cDNA并在鼠骨髓瘤細胞(SP20)中進行了表達[4]。IFN-γ具有抑制病毒復(fù)制、抑制細胞分裂以及免疫調(diào)節(jié)作用[5]。主要表現(xiàn)在：①促進MHCI類及II類抗原的加工提呈，提升CD4+T細胞的肽特異性活性[6-7]。②介導(dǎo)T細胞對巨噬細胞的激活，增強巨噬細胞殺傷微生物的能力。③活化NK細胞，提高NK細胞的殺傷活性，同時活化的NK細胞也能分泌IFN-γ。④促進NO的合成，是IFN-γ殺傷胞內(nèi)病原體、抗腫瘤以及抑制病毒復(fù)制的分子機制之一[8]。

本研究構(gòu)建了含有CaIFN-γ基因原核表達載體，并實現(xiàn)高效表達；進一步對復(fù)性后的包涵體進行干擾素抗病毒活性檢測；并將切膠純化后的包涵體免疫家兔，制備兔抗犬IFN-γ的多克隆抗血清，為開發(fā)新型基因工程苗、新型免疫佐劑及免疫治療劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α,E.coliRosetta，MDCK細胞，原核表達載體pET30a由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)微生物教研室保存，重組pJLA605-CaIFN-γ質(zhì)粒由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)微生物教研室構(gòu)建并經(jīng)序列鑒定；水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）為哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；IPTG（購自TaKaRa公司）；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（購自Sigma公司）；限制性內(nèi)切酶SalI、EcoR I及DNA Marker、T4DNA ligase、Taq酶（購自寶生物工程（大連）有限責(zé)任公司）；小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒與小量膠回收試劑盒均購自中科瑞泰生物有限公司；MTT購自Fluka公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗動物為2月齡家兔（購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計合成

根據(jù)2005年張海峰[9]發(fā)表的CaIFN-γ基因序列設(shè)計引物用于重組載體的構(gòu)建。P1:5'AGATCTTTCTTTAAAGAAATTG 3'，P2:5'GTCGA CTCACTATTTACTTGCTCTA 3'。

1.2.2 CaIFN-γ原核表達載體的構(gòu)建及工程菌的誘導(dǎo)表達

pJLA605-CaIFNγ質(zhì)粒和pET30a載體經(jīng)EcoR I、SalI雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳得到的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)中，挑菌落過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,雙酶切與PCR鑒定[10]。陽性重組質(zhì)粒命名為pET30a-caIFNγ。將陽性質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)到E.coliRosetta感受態(tài)中，挑陽性克隆菌于含卡那霉素（30 μg·mL-1）的LB培養(yǎng)液，37℃過夜振蕩培養(yǎng)后，將菌液按1:50接種于含有卡那霉素的 100 mL錐形瓶中，37℃培養(yǎng)至OD600約為0.4，加入IPTG至終濃度為2 mmol·L-1，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)并每小時取樣。

1.2.3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定

將IPTG誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后每小時的1 mL菌液12 000 r·min-1離心1 min，棄上清，加入50 μL PBS和等量2 x SDS（含DTT），煮沸10 min，取10 μL經(jīng)15%SDS-PAGE分析。將表達量最大的誘導(dǎo)菌液的上清和沉淀分別處理，確定蛋白表達形式。用半干轉(zhuǎn)印儀經(jīng)50 mA、40 min轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素（NC）膜上，再將NC膜在PBS配制的5%脫脂乳中封閉2 h，以1:1 000稀釋的his單抗室溫作用2 h，DAB顯色。

1.2.4 目的蛋白的復(fù)性

誘導(dǎo)的菌液，通過尿素梯度法進行包涵體粗提，采用切膠純化反復(fù)凍融的方法得到包涵體[11]，分5次加入到pH為8.0，0.5 mmol·L-1精氨酸復(fù)性液中，使蛋白終濃度為0.15 mg·mL-1，4℃作用24 h，然后將復(fù)性液放入透析袋中，浸入pH 7.2，0.15 mmol·L-1PBS中充分透析，用PEG6000濃縮至1/10體積，然后以0.22 μm的濾膜進行過濾除菌，用于細胞檢測蛋白的生物活性[12]。

1.2.5 抗病毒活性檢測

在96孔板上長滿單層的MDCK細胞中，加入以培養(yǎng)基進行2倍倍比稀釋的重組干擾素復(fù)性蛋白作用24 h（蛋白初始濃度為1.5 mg·mL-1，每個梯度做4個平行孔，共8個梯度），棄液，加入100 TCID50的VSV作用24～30 h，同時做細胞和病毒對照組，當(dāng)細胞病毒組80%～90%病變時，進行結(jié)晶紫染色。通過細胞病變抑制法對重組干擾素抗病毒活性進行分析[12]。

1.2.6 多克隆抗血清的制備

取切膠純化濃度為2 mg·mL-1的重組蛋白1 mL加入1 mL弗氏完全佐劑，充分乳化后，頸部背部皮下多點注射2月齡家兔。首免后14和28 d分別用純化蛋白1 mL加入弗氏不完全佐劑，進行加強免疫，于末次免疫后10 d，采血并分離血清。用間接ELISA方法測定抗體水平[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pET30a-caIFNγ經(jīng)EcoR I、SalI單、雙酶切和PCR鑒定。0.8%瓊脂糖凝膠電泳顯示，雙酶切和PCR檢測的插入片段長約440 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。表明成功將編碼CaIFN-γ成熟蛋白的基因正確插入到原核表達載體的目的位點（見圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pET30a-caIFNγ的酶切和PCR鑒定Fig.1 Enzyme digestion and PCR identification of recombinant plasmid of pET30a-caIFNγ

2.2 融合蛋白的表達、鑒定

15%SDS-PAGE分析表明,與誘導(dǎo)前比較，每小時誘導(dǎo)樣品均有一條明顯的蛋白帶，該蛋白的相對分子質(zhì)量約為23 ku，并且在誘導(dǎo)后5 h重組蛋白表達量達到最大，重組蛋白約占菌體總蛋白含量的63%。見圖2。

將第5 h誘導(dǎo)的菌體沉淀進行超聲處理，分別進行上清和沉淀的SDS-PAGE分析表明，蛋白主要以包涵體的形式存在，見圖3。Western Blot檢測可見重組蛋白與抗His標(biāo)簽的單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，結(jié)果表明重組的犬γ干擾素蛋白在大腸桿菌中獲得了表達。見圖4。

圖2 重組菌pET30a-CaIFN-γ/Rosetta不同時間的蛋白表達Fig.2 Expression of recombinant strains pET30a-CaIFN-γ/Rosetta in different Time

圖3 重組蛋白CaIFN-γ的表達形式分析Fig.3 Expression of the inclusion body of recombinant protein CaIFN-γ

圖4 重組蛋白CaIFN-γ的Western-blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant protein CaIFN-γ

2.3 重組蛋白CaIFN-γ的純化與復(fù)性

結(jié)果見圖5。

由圖5可知，經(jīng)尿素梯度法粗提的包涵體，進行切膠反復(fù)凍融之后濃縮平衡得到純度較高的目的蛋白。復(fù)性后，在約23 ku處有條清晰的重組CaIFN-γ目的蛋白帶。

圖5 重組CaIFN-γ蛋白的切膠純化和復(fù)性后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant protein CaIFN-γ by gel isolation and renaturation

2.4 重組CaIFN-γ蛋白復(fù)性后活性檢測

2倍倍比稀釋的重組CaIFN-γ蛋白作用于MDCK細胞，在2-4稀釋度（蛋白終濃度為0.09 mg·mL-1）于24 h之內(nèi)對接種VSV病毒的MDCK細胞有完全保護作用，見圖6。超過24 h后有不同程度的細胞病變產(chǎn)生。通過細胞病變抑制法結(jié)果顯示犬γ干擾素的抗病毒比活性為5.71×105U·mg-1。

圖6 重組CaIFN-γ對100TCID50VSV增殖24 h后的抑制作用Fig.6 Inhibition effect for the recombinant CaIFN-γ on replication of VSV after 24 h

2.5 多抗血清效價間接ELISA結(jié)果

以純化后濃度為1.25 μg·mL-1的重組蛋白包被ELISA反應(yīng)板，每孔100 μL，于4℃包被過夜，用1×PBS稀釋的5%脫脂乳于室溫封閉2 h，將待檢血清以2倍倍比稀釋后加入反應(yīng)板室溫作用2 h，對照采用未免疫健康兔血清并倍比稀釋，二抗1:5 000室溫作用2 h，計算結(jié)果。最后測定血清效價為1:12 800。

圖7 血清抗體效價測定結(jié)果Fig.7 Titrations of the antiserum prepared from immunized rabbit by ELISA coated with recombinant protein CaIFN-γ

3 討論與結(jié)論

干擾素因干擾病毒復(fù)制而得名，大量研究表明，干擾素除抗病毒外，還具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[14]。干擾素的抗病毒作用是間接地通過自分泌或旁分泌途徑，與細胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合后，活化多條細胞信號傳導(dǎo)通路上的蛋白分子來調(diào)節(jié)細胞的生長、分化，產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)及免疫反應(yīng)等效應(yīng)[15]。

本試驗用前期獲得的犬γ干擾素基因與pET30a原核表達載體成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，熱轉(zhuǎn)于大腸桿菌表達菌Rosetta中進行高效表達。通過對SDS-PAGE的分析表明，誘導(dǎo)5 h后，蛋白表達量達到峰值，同時上清和菌體的分別處理進一步確定蛋白以包涵體表達為主，這與大腸桿菌的結(jié)構(gòu)及強啟動子表達系統(tǒng)有關(guān)。一定程度上，利于蛋白的純化，防止被蛋白酶降解。

雖然大腸桿菌表達的γIFN沒有糖基化修飾，但研究表明仍具有生物活性[16]。各種動物IFNγ的氨基酸同源性不同，但其基本的空間結(jié)構(gòu)類似。IFN的生物學(xué)效應(yīng)具有高度的種屬特異性，即人IFN對動物沒有生物學(xué)活性，反之亦然[17]。本試驗中，將復(fù)性后的蛋白進行生物活性檢測發(fā)現(xiàn)，2-4倍稀釋的蛋白在24 h內(nèi)對細胞有較好的保護作用，但隨著時間變化，病毒的繁殖，24 h后會有不同程度的病變。而2-1，2-2，2-3稀釋度蛋白有一定的毒性作用，未接種病毒時，對細胞已經(jīng)造成損傷，這可能與加入目的蛋白濃度過高，大腸桿菌內(nèi)毒素以及細胞營養(yǎng)成分不充分有關(guān)。而2-5，2-6，2-7，2-8會有不同程度的細胞病變，這可能跟目的蛋白稀釋后濃度過低，抗病毒作用減弱有關(guān)。

與昂貴而繁瑣的鎳柱純化相比，本試驗采用反復(fù)凍融切膠純化法純化蛋白，此方法適用于包涵體形式的高表達量蛋白純化，操作方便，試驗周期短，價格低廉，應(yīng)用范圍廣。而且采用KCl染色，不影響蛋白抗原性及后續(xù)純化。

本研究獲得的具有體外抗病毒活性的重組γ干擾素蛋白和抗γ干擾素蛋白的多克隆抗體，為γ干擾素的深入研究和在生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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