劉山輝 遼寧職業(yè)學(xué)院,遼寧鐵嶺 112001

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌種來源

來源于本地區(qū)11家肉種雞場和商品肉雞場發(fā)病雞病料分離培養(yǎng)物。

1.2 藥品與試劑

（1）革蘭氏染液、美藍(lán)染液、微量發(fā)酵管（由遼寧檢驗(yàn)檢疫局檢測中心提供）。

（2）致病性大腸桿菌陽性血清購自中國獸藥監(jiān)察所。

（3）抗菌原液：將各種抗菌藥物稀釋成2mg/ml，中草藥稀釋成相當(dāng)于含原生藥1g/ml。

（4）中草藥組方（每克）

雙黃連：金銀花：0.4g黃連0.6g

白頭翁散：白頭翁0.35g黃連0.25g黃柏0.25g秦皮0.15g

三黃加白散：黃連0.35g黃柏0.25g黃岑0.25g白頭翁0.15g

苦參合劑：苦參0.6g黃連0.4g魚腥草粉劑：魚腥草粉劑1g穿心蓮粉劑:穿心蓮粉劑1g

1.3 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基。

1.4 藥敏紙片

購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司，中草藥藥敏紙片為自制（相當(dāng)于含原生藥10mg/片）。

1.5 儀器

微量移液器、恒溫箱、微生物接種用具。

2 試驗(yàn)步驟

2.1 致病性大腸桿菌的分離與鑒定

2.1.1 菌種的分離

剖檢病死雞，無菌操作采取病死雞的心血、肝臟病料接種于乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，進(jìn)一步移接至伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，挑選典型菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，作為試驗(yàn)菌種保存。

2.1.2 生化試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌種分別接種于微量發(fā)酵管，置滅菌培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)24～48h，觀察發(fā)酵情況。在培養(yǎng)48 h后，加入靛基質(zhì)試劑于蛋白胨水中，檢查是否有靛基質(zhì)生成。

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的菌種能發(fā)酵甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、蕈糖、果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，靛基質(zhì)試驗(yàn)和M.R試驗(yàn)陽性，山梨醇、鳥氨酸試驗(yàn)結(jié)果陽性。V-P試驗(yàn)、衛(wèi)矛醇、肌醇、硝酸鹽、酒石酸鹽、水楊素、精氨酸水解酶、阿拉伯醇、血清菊糖、鳥氨酸、精氨酸脫羧酶、丙氨酸鹽、乙酰胺利用試驗(yàn)結(jié)果陰性。經(jīng)生化特性鑒別，證明病料中分離出的細(xì)菌是病原性大腸桿菌。

2.1.3 血清型鑒定

采用試管凝集方法，用每ml含10～60億菌體抗原的肉湯培養(yǎng)物，加上等量的被檢動物菌體抗原陽性血清，菌體抗原陽性血清分別為搖晃均勻，在 2～3m in內(nèi)，如發(fā)生凝集反應(yīng)者為陽性反應(yīng)，不凝集者則為陰性反應(yīng)，根據(jù)陽性血清的抗原種類判定被檢菌株的血清型。結(jié)果如表1。

表1 大腸桿菌血清型鑒定結(jié)果

2.2 誘導(dǎo)前藥敏試驗(yàn)

根據(jù)血清學(xué)試驗(yàn)，將優(yōu)勢血清型O78作為進(jìn)一步試驗(yàn)研究對象。試驗(yàn)前將試驗(yàn)菌種在無藥乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基上繼代接種培養(yǎng)10代，盡量消除已產(chǎn)生的耐藥性。采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，用無菌棉拭蘸取菌液，無菌操作涂布接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，粘貼藥敏紙片，置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16～18h后觀察結(jié)果。結(jié)果如表2。

表2 誘導(dǎo)前藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 耐藥誘導(dǎo)試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取原始藥敏試驗(yàn)中抑菌直徑大于等于15mm的抗菌藥物作為進(jìn)一步試驗(yàn)研究對象，進(jìn)行耐藥誘導(dǎo)試驗(yàn)。操作方法如下：

（1）取已加入5m l乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基試管27支，在無菌操作臺上將每管中分別用微量移液器移入一種抗菌藥物原液，計(jì)算移入藥液量，使各管中抗菌藥物濃度達(dá)到抗菌原液的10-5，混勻，并作好標(biāo)記，余一管作空白生長對照。

（2）無菌操作將試驗(yàn)菌種接入各試管中，作抗菌藥物的適應(yīng)性培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h，結(jié)果大腸桿菌均能在該濃度培養(yǎng)液中生長良好。

（3）另取已加入5m l乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基試管27支，同樣的無菌操作方式，將試管中各抗菌藥物抗菌原液加至10-4，同樣作好標(biāo)記，將上述適應(yīng)培養(yǎng)的大腸桿菌相對應(yīng)的移接至該濃度培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng) 24h。

（4）當(dāng)大腸桿菌在培養(yǎng)基中生長良好時(shí)即可移接入下一個(gè)10倍梯度的對應(yīng)抗菌藥物培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，否則仍在同一梯度中繼代培養(yǎng)，直至生長良好，同時(shí)記錄細(xì)菌的生長情況。觀察培養(yǎng)結(jié)果。耐藥誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果如表3。

表3 耐藥誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

2.4 誘導(dǎo)耐藥后的藥敏試驗(yàn)

當(dāng)細(xì)菌不斷的適應(yīng)含藥培養(yǎng)基環(huán)境而產(chǎn)生耐藥性后，隨著抗菌藥物濃度的10倍遞增，在某一濃度仍無法繼續(xù)良好的生長和繼代時(shí)，即可停止該藥物的耐藥試驗(yàn)，保留末代產(chǎn)生耐藥的菌種，并分別用紙片法作末代耐藥菌種對抗菌藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果如表4。

表4 耐藥后的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 敏感性恢復(fù)試驗(yàn)

將已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌末代培養(yǎng)物分別移接至無藥的乳糖膽鹽肉湯中繼代培養(yǎng)，并作原耐藥名稱的標(biāo)記，37℃培養(yǎng)24h為一代。每代培養(yǎng)后，均用原抗菌藥敏紙片作藥敏試驗(yàn)，直至細(xì)菌對已耐藥的抗菌藥物敏感性最大程度的恢復(fù)，即可停止繼代培養(yǎng)，并記錄試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果如表5。

3 試驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 鐵嶺地區(qū)雞大腸桿菌病普遍存在，分離的致病性大腸桿菌血清型為 O1、O2、O35、O36、O78、O111，其中O78為優(yōu)勢血清型。

3.2 從該地區(qū)分離出的雞致病性大腸桿菌對中草藥復(fù)方制劑呈高度敏感狀態(tài)，并且?guī)缀醪划a(chǎn)生耐藥性，因此應(yīng)為本地區(qū)的雞性大腸桿菌病防治的首選藥物。

3.3 從該地區(qū)分離出的雞致病性大腸桿菌對氟苯

表5 敏感性恢復(fù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果

尼考、頭孢噻呋、頭孢啉唑、多粘菌素B均為高度敏感，產(chǎn)生一定耐藥后仍呈現(xiàn)出高度敏感性，產(chǎn)生耐藥性慢并且恢復(fù)較快。因此適于本地區(qū)的雞性大腸桿菌病的防治。。

3.4 從該地區(qū)分離出的雞致病性大腸桿菌對慶大霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、蒽諾沙星、培氟沙星，磷霉素鈉呈高度敏感狀態(tài)，但很容易產(chǎn)生耐藥，耐藥產(chǎn)生速度快，耐藥后敏感性明顯降低，呈現(xiàn)出中敏或低敏。但停藥后又能有不同程度的恢復(fù)。因此可突擊性使用防治本地區(qū)的雞性大腸桿菌病，不宜連續(xù)使用。

3.5 分離出的雞致病性大腸桿菌對磺胺類藥耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥產(chǎn)生明顯，一定時(shí)期內(nèi)無法恢復(fù)敏感性。

3.6 本次試驗(yàn)的操作不在于設(shè)備和儀器的先進(jìn)程度，主要是充分的應(yīng)用了獸醫(yī)專業(yè)的微生物學(xué)和藥理學(xué)的基本理論，靈活機(jī)動地設(shè)計(jì)出試驗(yàn)的步驟和方法，利用常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室和藥理實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)備即可完成試驗(yàn)內(nèi)容，對于其他類抗菌藥物和新型的抗菌藥物的試驗(yàn)和測試有一定的借鑒價(jià)值。

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