萬志兵 王小龍 管宏偉 仰皖旭 尹佟明 張新葉

(江蘇省楊樹品種改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室(南京林業(yè)大學)，南京，210037) (湖北林業(yè)科學研究院)

楊樹(Populus)是我國適生范圍較廣的樹種之一，是重要的速生豐產(chǎn)工業(yè)用材、四旁綠化、農(nóng)田林網(wǎng)和防風固沙樹種。隨著我國木材用量的不斷增加，楊樹大面積推廣，全國楊樹人工林的栽培面積超過700萬hm2，其中大部分為單一品種構(gòu)成的純林。雖然大面積純林可為工業(yè)利用提供品質(zhì)較為均一的原材料，但在營林方面暴露出一些弱點，特別是容易導致病蟲害的暴發(fā)流行，造成嚴重減產(chǎn)。楊樹銹病是楊樹生產(chǎn)中的一種主要病害［1］。夏秋季節(jié)，葉片出現(xiàn)大量黃色銹粉物(夏孢子)，嚴重發(fā)生時會布滿整個葉片和林帶，導致提早落葉，嚴重影響樹木光合和生長。防治該病經(jīng)濟、有效和環(huán)境安全的方法是利用抗病品種。然而，由于楊樹銹菌具有高度的變異性和種植抗病品種造成的選擇壓力，楊樹銹菌種群變異很快，毒力結(jié)構(gòu)十分復雜［2］。楊樹銹菌致病變異性一般是通過接種不同楊樹品種進行毒力檢測來評價［3］。用致病性作為病原菌遺傳變異的指標存在一些缺點，如費工費時、需要很大的溫室空間、受溫濕度及接種技術(shù)等的影響大，而且由于抗病性和感病性的分類受主觀性因素影響，表型變異往往不穩(wěn)定。因此，需要利用更加有效的手段來進行楊樹銹菌的鑒定和研究楊樹銹菌的變異情況。

分子標記技術(shù)已成為植物病原真菌遺傳變異研究和檢測的重要手段。一些基于DNA的分子標記，如rDNA－ITS，RFLP，RAPD等技術(shù)也已應用于楊樹銹菌的鑒定、遺傳變異及多樣性、無毒基因作圖等研究［4－8］。與RFLP及RAPD等分子標記相比，SSR是一種更加有效的標記技術(shù)。SSR標記雖然在一些植物和動物中已被廣泛開發(fā)和應用，但在真菌中卻開發(fā)得很少［9－12］。簡單序列重復(simple sequence repeats，SSRs)或微衛(wèi)星(microsatellites)是以1～6個堿基為基元的串聯(lián)重復序列，它們普遍存在和隨機分布于大多數(shù)真核生物的基因組中，重復數(shù)具有高頻率的變異，這種專化位點的多態(tài)性可以十分容易地通過設計特異引物進行PCR擴增檢測［13］。SSR標記具有多態(tài)性高、多等位性、共顯性、容易用PCR檢測、重復性高等特點，是一種理想的分子標記，但開發(fā)SSR標記需要事先知道基因組序列信息，對沒有基因組序列的物種而言，開發(fā)SSR標記是昂貴和低效的［13－14］。隨著表達序列標簽(expressed sequence tag，EST)技術(shù)的發(fā)展，EST數(shù)據(jù)庫為開發(fā)SSR標記提供了快速、有效和廉價的途徑［15］。EST是通過對cDNA文庫中隨機挑取的克隆進行大規(guī)模測序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長度一般為150～500 bp。近年來隨著功能基因組的研究，大量的EST數(shù)據(jù)收錄于NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國家生物信息技術(shù)中心)，為EST－SSR標記的開發(fā)提供了豐富的序列資源。由于EST－SSR標記開發(fā)是基于基因組中的表達序列，因此標記要近緣物種間有很高的通用性［16－19］，再加上現(xiàn)在高度發(fā)展的信息技術(shù)為從EST序列中開發(fā)SSR標記提供了豐富的軟件［20］，這一切都使得EST－SSR標記成為當今熱門的分子標記技術(shù)。一些植物如葡萄、小麥的EST－SSR標記已開發(fā)利用［21－24］。在植物病原真菌中，Kaye 等人［9］也開發(fā)了少量水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的EST－SSR標記，朱振東等［25］報道了從大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann＆Gerdemann)的EST序列中開發(fā)的EST－SSR標記。

迄今，在GenBank中已有6萬多條楊樹銹菌EST序列。本研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫中楊樹銹菌的EST序列，對這些序列進行了拼接和組裝，在此基出上，開展了這些序列所含微衛(wèi)星的查找，并對楊樹銹菌基因組中基因轉(zhuǎn)錄序列所含微衛(wèi)星重復序列的特征和組成情況進行了分析，然后根據(jù)所發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星位點設計SSR引物，并隨機選取了部分引物對進行了試驗分析，以期為楊樹銹菌的研究提供有價值的遺傳工具和分子標記資源。

1 材料與方法

1.1 楊樹銹菌EST-SSR序列的檢索

從GenBank的dbEST數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)以 FASAT 格式下載楊樹銹菌EST序列。序列拼接的計算機為Power Edge T710(內(nèi)存60G)，使用的軟件為GS De nove Assembler，拼接參數(shù)采用默認值。采用C語言編輯的 Sputnik(C.Abajian，University of Washington)程序進行所有重復單元長度為2～5個堿基的微衛(wèi)星的查找，程序默認閾值最小Score設定為9。

不同重復單元微衛(wèi)星密度的計算:D=N/L。D為不同重復單元微衛(wèi)星密度;N為各重復單元微衛(wèi)星數(shù)量;L為楊樹銹菌EST序列拼接片段總長。

將所有回紋重復序列及其互補的序列歸為一類，如 AAG 基序代表所有 AAG、AGA、GAA、CTT、TCT和TTC的SSR。據(jù)此，2核甘酸重復序列歸為4類，3核甘酸重復序列歸為10類，4核甘酸重復序列歸為33類，5核甘酸重復序列歸為102類。

1.2 EST-SSR 引物設計

應用引物設計軟件Primer Premier 5.0和Oligo6.0設計楊樹銹菌EST－SSR引物。Primer Premier 5.0主要用于引物的自動檢索，其基本檢索條件為:EST序列長度大于100 bp;EST－SSR序列的開始和結(jié)束分別距5’和3’端不少于20 bp;引物長度18～24 bp;GC含量40% ～60%;理論退火溫度(Tm)40～60℃;預計PCR擴增產(chǎn)物長度控制在100～500 bp;盡量避免引物二級結(jié)構(gòu)dimer、hairpin、falseprimer以及連續(xù)6個堿基配對的出現(xiàn)。Oligo 6.0主要用于對檢索到的引物進行評價分析:正反引物的Tm值相差不能超過5℃，5’端Tm稍微高于3’端Tm。設計的引物上傳至網(wǎng)址 ftp://202.119.210.12，讀者可與作者聯(lián)系下載引物數(shù)據(jù)庫。我們從表中隨機挑選了30對引物(數(shù)據(jù)庫中紅色標記部分)用于引物的試驗驗證，這些引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 楊樹銹菌DNA提取與EST-SSR引物驗證

以南京林業(yè)大學樹木園采集的楊樹銹菌為材料，利用北京天恩澤基因科技有限公司玻璃珠法柱式真菌DNAout提取銹菌總DNA。

PCR擴增反應體系采用10 μL反應體系，其中含有 1×buffer，Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.4 μmol/L，Taq 酶1.0 U，模板DNA 50 ng。反應程序為:94℃預變性85 s，94℃變性35 s，引物退火溫度60 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán);72℃終延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測，120 V電壓電泳40 min后，用Gel Image System Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)成像。有擴增產(chǎn)物的樣品采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法顯色檢測DNA條帶的多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星豐度及分布密度分析

在楊樹銹菌的64498條EST中，經(jīng)過拼接得到1998個拼接片段，進行2～5個核苷酸重復的SSR位點搜索發(fā)現(xiàn)604個SSR位點，拼接片段含有SSR位點的頻率為30.23%，總共有420個拼接片段含有SSR位點，平均1個片段含有1.44個SSR位點，1個片段含有的SSR位點數(shù)最多的是6個，69.05%的拼接片段只含有1個SSR位點，見表1。拼接片段的總長度是444 907 bp，平均736.6 bp含有1個SSR位點。

表1 拼接片段中含有SSR位點數(shù)

本研究查找的EST序列中所含微衛(wèi)星為二核苷酸至五核苷酸重復，其中三核苷酸重復的數(shù)量最多，占全部SSR的44.70%，為優(yōu)勢重復基序。二核苷酸、四核苷酸、五核苷酸所含微衛(wèi)星所占比例分別為 17.05%、17.72%、20.53%。不同重復單元微衛(wèi)星由于數(shù)量差異較大，所以分布密度的變化也很大，見表2。

表2 不同長度重復單元微衛(wèi)星所占百分比及分布密度

2.2 微衛(wèi)星優(yōu)勢重復單元堿基組成

在二堿基重復類型中，AG基序重復的數(shù)量最多，共41 個，占39.8%;其次是 AC，33 個，占32.0%;AT基序重復的數(shù)量也達28個，占27.2%;而CG基序只有一個。在10種三堿基重復類型中，AGT基序數(shù)量最多，共69個，占25.6%;其次為AAG(22.6%)和ACT(14.4%)，其他重復基序則相對較少。四堿基重復類型共20種，AAAG基序數(shù)量最大，共19個占17.76%;AATC(14.95%)、AAAC(14.02%)次之;這3種類型基序占了四堿基重復類型總量的46.73%。24種五堿基重復類型中AAAAC基序數(shù)量最大，共21 個占16.9%;其次為AAAAG(12.9%)，見表3。從以上分析可以看出，在楊樹銹菌的EST中，檢測到的四和五堿基重復的SSR的種類都不多，可能是在不同物種中，SSR出現(xiàn)的種類存在偏好。

表3 不同長度重復單元微衛(wèi)星中各重復單元含量比例

總體而言，在楊樹銹菌EST中最豐富的微衛(wèi)星類型是三堿基重復微衛(wèi)星，其次為四堿基重復微衛(wèi)星，最主要的優(yōu)勢重復序列分別是AGT、AAG以及AG類。而在四堿基、五堿基重復類型中，(AAAN)n和(AAAAN)n分別比同類型其他組合的基序數(shù)量大。這些處于優(yōu)勢數(shù)目的重復拷貝類型富含A和T堿基。

2.3 微衛(wèi)星長度分布及變異分析

本研究中楊樹銹菌EST序列中微衛(wèi)星的平均長度為26.07 bp，最長的為58 bp，最短11 bp。長度大于20 bp的微衛(wèi)星僅占總數(shù)的15.07%(表4)。

表4 楊樹銹菌微衛(wèi)星長度分布及不同長度微衛(wèi)星頻率

基序重復次數(shù)的變異引起位點長度的變化是產(chǎn)生EST－SSR位點多態(tài)性的主要原因。進一步對不同長度重復單元的楊樹銹菌微衛(wèi)星的長度變異情況進行了分析(表5)，從扇形部分數(shù)量的變化可以看出，三堿基重復微衛(wèi)星重復單元的變化次數(shù)顯著高于其他重復類型微衛(wèi)星的重復單元變化次數(shù)。長度變異程度最高的為三堿基重復微衛(wèi)星，變異程度最低的為五堿基重復微衛(wèi)星。

表5 不同長度重復單元微衛(wèi)星變異情況

2.4 楊樹銹菌EST-SSR引物設計及篩選

根據(jù)SSR位點，共設計了455對SSR引物，隨機抽取了30對SSR引物，對楊樹銹菌基因組DNA進行擴增，除3對引物未產(chǎn)生擴增產(chǎn)物外，其余27對引物(90.0%)均擴增出SSR特征條帶(圖1)。

圖1 部分引物對楊樹銹菌基因組DNA擴增產(chǎn)物

在27個功能性引物對中，有19個引物對擴增出1條產(chǎn)物帶，其中有13個引物對的擴增產(chǎn)物在預期片段大小范圍之內(nèi)，6個引物對的擴增產(chǎn)物大于預期片段大小;有8個引物對擴增出2條或2條以上條帶，都存在擴增出在預期片段大小范圍之內(nèi)的的條帶。共有21個引物對擴增出在預期片段大小范圍之內(nèi)的的條帶，占功能性引物對的77.8%。

3 結(jié)論與討論

對64 498條楊樹銹菌EST進行篩選組裝，拼接成1 998個片段，共發(fā)掘了604個SSR位點，篩選組裝的楊樹銹菌片段序列平均每736.6 bp含有1個SSR。采用同樣的參數(shù)和分析方法，其他真菌中，香菇的EST序列平均每25.924 kb含有1個SSR位點［26］，大豆疫霉菌的EST序列平均每8.9 kb含有1個SSR［25］，表明楊樹銹菌含有SSR的頻率很高，SSR十分豐富。由于微衛(wèi)星序列是生物基因組中變異最為迅速的一類序列，楊樹銹菌表達序列中微衛(wèi)星含量很高，將導致楊樹銹菌基因有很高的變異頻率，我們推測微衛(wèi)星序列是楊樹銹菌基因變異迅速的重要驅(qū)動力。在鑒定的楊樹銹菌EST－SSR中以三核苷酸重復基元最豐富，占鑒定總數(shù)的50.1%。本研究的結(jié)果與以前報道的在一些植物中的研究結(jié)果一致［23，27－28］。在基因編碼區(qū)主要存在三核苷酸重復類型可能是三核苷酸重復數(shù)的變異不會引起移碼突變，從而減少突變的壓力。Gao等人［23］發(fā)現(xiàn)許多三核苷酸與具有重要功能的基因相關，如CCG重復涉及許多基因的功能，如脅迫抗性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號傳導等。

Rota L R等人［29］曾提出若EST－SSR數(shù)目足夠大和無偏倚性，則4種不同的堿基隨機組合將產(chǎn)生4種二核苷酸、10種三核苷酸、33種四核苷酸和102種五核苷酸基本重復基元類型。楊樹銹菌ESTSSR分析的結(jié)果表明，楊樹銹菌不同重復基元出現(xiàn)的類型表現(xiàn)出很大的偏倚性。二核苷酸中GC重復單元只出現(xiàn)一次，遠遠低于其他重復單元。在桃樹［30］、擬南芥［31］、大豆［23］等植物的研究中也表明存在很大的偏倚性，沒有出現(xiàn)GC重復基元。

按照Temnykh［32］的劃分，按照長度將微衛(wèi)星分為兩大類:長度大于等于20 bp的SSR和長度大于12 bp但小于20 bp的SSR。與第二類SSR相比，第一類SSR序列長度更長，具有更高的突變率，因而更不穩(wěn)定。本實驗對604個微衛(wèi)星長度進行分析發(fā)現(xiàn)，楊樹銹菌EST序列所含微衛(wèi)星在長度上存在極顯著的變異，微衛(wèi)星長度從11～58 bp不等，微衛(wèi)星平均長度為26.07 bp。微衛(wèi)星主要為長度較短的重復序列，長度大于20 bp的序列僅占微衛(wèi)星總數(shù)的15.07%。在簡單重復序列中，序列越長變異就越大，其多態(tài)性就可能越豐富，就越有利于EST－SSR標記的開發(fā)［33－34］。在楊樹銹菌 EST－SSR 位點中重復最長的是五核苷酸中長度為58的一段SSR。EST－SSR的多態(tài)性主要是由于重復長度和重復次數(shù)造成的［35］。SSR一般認為是由于DNA復制過程中聚合酶瞬時脫離、堿基錯配引起的，楊樹銹菌EST序列中SSR重復基元的重復次數(shù)為1～111，最大的重復次數(shù)出現(xiàn)在三核苷酸中。詹少華等［36］首次統(tǒng)計了SSR基元重復次數(shù)變異范圍，推測SSR基元重復次數(shù)變異范圍越大，分子標記的多態(tài)性越高，而且也認為SSR重復基元重復次數(shù)變異的發(fā)生也與SSR形成有關。研究楊樹銹菌EST－SSR重復基元的重復次數(shù)對于楊樹銹菌EST－SSR引物擴增多態(tài)性分析有重要的意義。

隨著植物病原菌基因組研究的發(fā)展，多種不同類型植物病原菌的EST已被開發(fā)。從EST數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘SSR標記，為植物病原菌SSR標記的發(fā)展提供了一種便利的途徑。SSR一般都有2～5個等位位點，在植物病原菌研究中不但可以用于種群遺傳多樣性、近緣種的比較及系譜研究［37－38］，而且還可用于不同寄主的分離物之間的比較［39－40］，或是菌株、小種之間的比較［37－38，41］。本研究從楊樹銹菌EST中發(fā)掘SSR標記，證明了這種途徑的有效性和高效性。雖然EST－SSR標記與其他一些從非編碼區(qū)分離的標記相比在種內(nèi)檢測的多態(tài)性水平要低，但他們檢測的是基因組表達部分的變異，是真正與性狀連鎖的標記，這將可能對決定重要表型性狀的等位基因進行直接鑒定。另外，EST－SSR標記具有很高的通用性，一旦開發(fā)，可以在近緣種(屬)中應用。因此，楊樹銹菌EST－SSR標記的開發(fā)利用，為楊樹銹菌及近緣種屬的鑒別、遺傳變異等研究提供了重要的標記資源。楊樹銹菌EST－SSR的開發(fā)也將會促進楊樹抗銹病育種的研究。

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