【作者】衣麗婷，劉靜,2*

1 清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，北京，100084

2 中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所，北京，100190

1 腫瘤現(xiàn)狀及早期檢測(cè)的重要意義

近年來，惡性腫瘤已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康及生命的重大疾病之一。人們談“癌”色變，并普遍認(rèn)為癌癥為不治之癥，這主要源于其治愈率低、死亡率高并具有廣泛的分布性。在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國家，癌癥已成為使人致死的最主要原因；在發(fā)展中國家，癌癥的死亡率在所有疾病的死亡率中位居第二位[1-2]。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2008年，全世界的癌癥患者約有1270萬人，其中死亡人數(shù)高達(dá)760萬[3]。世界衛(wèi)生組織(WHO)專家預(yù)測(cè)，癌癥將成為人類生命的頭號(hào)殺手[4]。

迄今，世界各國投入了大量的人力、物力用于腫瘤的預(yù)防、診斷和治療。每年，美國癌癥協(xié)會(huì)都會(huì)發(fā)布關(guān)于腫瘤早期診斷建議的指南[5]，包括自檢和臨床檢查的內(nèi)容。該協(xié)會(huì)發(fā)布的導(dǎo)致全球主要經(jīng)濟(jì)損失的前十五位死亡原因[6]中，惡性腫瘤疾病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高居榜首。腫瘤的高致死率主要由于腫瘤細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力，約90%腫瘤病人的死亡源于腫瘤的轉(zhuǎn)移，然而早期的治療干預(yù)則會(huì)提高治療效果[7]。在腫瘤確診之前若病灶已發(fā)生多處微小轉(zhuǎn)移，即使有些惡性腫瘤如睪丸癌仍可能治愈，但希望大大降低[8]。由此看來，早期診斷和治療對(duì)于提升腫瘤病人生存率具有至關(guān)重要的意義。發(fā)展中國家腫瘤患者的死亡率要高于經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國家，極有可能的原因就在于診斷不及時(shí)；此外，疾病普查范圍小，在治療時(shí)間和技術(shù)水平上存在局限性也是重要因素[9]。

表1 TNM分期及臨床意義Tab.1 TNM classification and clinical significance

腫瘤是一組復(fù)雜的疾病，從微觀的基因變異，到宏觀的器官侵害，不同病例之間存在著相似和差異。為了更好的描述惡性腫瘤的發(fā)展程度，便于醫(yī)生對(duì)病情的掌握及病人對(duì)自身病況的認(rèn)知，臨床上采用腫瘤的分期系統(tǒng)來對(duì)此進(jìn)行分類、劃分。目前，國際上普遍采用也相對(duì)成熟的分期系統(tǒng)為TNM分期系統(tǒng)(表1)[4],[8]，系美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）和國際抗癌聯(lián)盟（UICC）所建立，其中的具體分期隨著研究的不斷深入有所更新和調(diào)整。TNM分期分為臨床分期和病理分期。在某些部位，還可以進(jìn)一步分級(jí)。部分國家和地區(qū)對(duì)于某類腫瘤也存在著不同的分類方法。根據(jù)檢測(cè)確定TNM中的T、N、M后，即可得出相應(yīng)的總分期，即I期、II期、III期等，不同部位腫瘤的T、N、M中對(duì)應(yīng)的總分期也略有差異[10]。國內(nèi)學(xué)者公認(rèn)I期屬于腫瘤早期，治療和預(yù)后都有較好效果。分期級(jí)別越高，腫瘤進(jìn)展程度越高。

當(dāng)前一些較為常用的檢測(cè)手段，如X線、超聲、PET-CT、核磁共振成像等影像方法在腫瘤診斷方面的作用是值得肯定的，但由于準(zhǔn)確度等問題，它們?cè)谂R床應(yīng)用上仍存在局限性，有時(shí)甚至?xí)c病理診斷結(jié)果存在出入。并且如核磁共振這一類檢測(cè)對(duì)于一般家庭而言，多次檢測(cè)所需的費(fèi)用是無法承受的，這也就導(dǎo)致了在腫瘤檢測(cè)時(shí)間上的延誤；一些有一定放射性的檢測(cè)方法，如X線、CT、PET或其組合，也不適于頻繁檢測(cè)；而通過穿刺獲取病人組織樣品并進(jìn)行組織化學(xué)分析這一方法，耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜且對(duì)病人損害較大。相比而言，腫瘤早期檢測(cè)期望實(shí)現(xiàn)具有對(duì)正常人群及疑似患病人群初步診斷并允許頻繁檢測(cè)的目標(biāo)，從這些角度來看，以上方法均不適合作為廣泛人群腫瘤早期檢測(cè)。

發(fā)展低成本、易操作、便攜式、低損傷、高準(zhǔn)確性和快速的腫瘤早期檢測(cè)方法為當(dāng)前所急需。相應(yīng)方法的成功實(shí)現(xiàn)，將會(huì)對(duì)腫瘤病人治療方案的制定提供有價(jià)值的信息資料，并且能對(duì)經(jīng)過治療的腫瘤病人病情起到即時(shí)的監(jiān)測(cè)作用，保證最佳的治療期，而這一點(diǎn)是傳統(tǒng)檢測(cè)方法所難以實(shí)現(xiàn)的。

2 腫瘤早期檢測(cè)的切入點(diǎn)

實(shí)現(xiàn)腫瘤早期檢測(cè)的首要任務(wù)就是要揭示腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞，以及腫瘤組織與正常組織的區(qū)別，以此作為制定檢測(cè)方案的依據(jù)。本文將從兩方面進(jìn)行評(píng)述：生物學(xué)特性，包括腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的本質(zhì)差異、導(dǎo)致差異產(chǎn)生的根本原因；物理學(xué)特性，相應(yīng)技術(shù)發(fā)展成熟，可望使整個(gè)檢測(cè)過程簡(jiǎn)化、可靠。

2.1 腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)

人類腫瘤細(xì)胞在發(fā)展的多階段，表現(xiàn)出多種不同于正常細(xì)胞的生物學(xué)特征[14]，這些特征主要保障和完成腫瘤的無限增殖功能和侵襲轉(zhuǎn)移至其他身體部位的能力。正常的細(xì)胞經(jīng)過程序性的調(diào)控，最終會(huì)走向凋亡，而腫瘤細(xì)胞由于基因的改變，生長(zhǎng)不受限制，能跳過凋亡階段，不斷獲取營養(yǎng)，不斷增殖和代謝。

(1) 基因標(biāo)記物

細(xì)胞發(fā)生癌變的本質(zhì)為細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的改變。所有人類體內(nèi)都存在癌基因，癌癥病人與健康人群的區(qū)別在于癌癥病人的癌基因異常表達(dá)，抑癌基因丟失或失去活性。例如，結(jié)腸癌是因正常的上皮細(xì)胞發(fā)生APC基因的喪失或突變，DNA甲基化異常，Ras基因突變和DCC、p53基因喪失等基因改變而形成腫瘤。隨著PCR方法的普及與發(fā)展，利用基因擴(kuò)增檢測(cè)異?；虻姆椒ㄒ延性絹碓綇V泛的應(yīng)用。

(2) 蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物

蛋白質(zhì)是基因的產(chǎn)物，正常細(xì)胞發(fā)生癌變，基因異常表達(dá)，對(duì)應(yīng)編碼的蛋白質(zhì)也會(huì)隨之改變。大量研究表明，一些蛋白質(zhì)在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織表達(dá)水平。這些蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物的出現(xiàn)已成為診斷腫瘤疾病的重要工具[15]。檢測(cè)的基本原理主要為腫瘤特異性抗原與其對(duì)應(yīng)抗體特異性結(jié)合。另外，通過蛋白質(zhì)組學(xué)與其他技術(shù)的結(jié)合也是目前常用檢測(cè)方法，如凝膠電泳、液相層析、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)等。不同腫瘤細(xì)胞表達(dá)的生物標(biāo)記物的種類和含量也有所不同，例如，PSA為前列腺癌的生物標(biāo)記物，前列腺癌患者血清中PSA會(huì)有所升高；CA125為卵巢癌的生物標(biāo)記物；AFP為肝癌的標(biāo)記物等。表2中列出的是已知用于腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)記物[16]。在腫瘤檢測(cè)中，這些常用的腫瘤標(biāo)記物都有對(duì)應(yīng)的閾值[17][18]。腫瘤蛋白質(zhì)標(biāo)記物的檢測(cè)已作為醫(yī)院判斷病人是否患有腫瘤的常用輔助手段。

表2 已知與腫瘤診斷和預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物[16]Tab.2 Known biomarker associated with cancer diagnosis and prognosis

2.2 腫瘤細(xì)胞的物理特性

腫瘤細(xì)胞在遺傳因素或環(huán)境因素的作用下，基因、細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這種變化會(huì)導(dǎo)致其物理性質(zhì)與正常細(xì)胞產(chǎn)生差異，也因如此，人們可以采用物理方法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。圖1為腫瘤細(xì)胞接受信息的變化、腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變以及與物理性質(zhì)變化間的關(guān)系圖，粗框內(nèi)特性為可用以檢測(cè)的物理量。針對(duì)這些物理量，已有大量的文獻(xiàn)對(duì)應(yīng)做出研究，例如，密度的改變可用密度梯度方法進(jìn)行分離；細(xì)胞大小和變形性的改變可以用過濾的方法進(jìn)行分選；氣味的改變可以通過具有靈敏嗅覺的動(dòng)物進(jìn)行辨別等。以下對(duì)此分別討論。

圖1 腫瘤物理性質(zhì)的改變Fig.1 Changes in physical properties of cancer cells

3 腫瘤檢測(cè)的方法

3.1 典型途徑

一般情況下，臨床上腫瘤的常規(guī)診療流程[5]如圖2所示。病人到醫(yī)院就診，醫(yī)生通過詢問家族病史、觸診、身體檢查等環(huán)節(jié)做出初步判斷。如果病情嚴(yán)重，有明顯病變跡象，則需要直接在疑似部位取組織標(biāo)本，穿刺活體檢查，通過細(xì)胞生物學(xué)變化、病理學(xué)特征確診。經(jīng)體檢后，如果疾病表象不明顯，則需要繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)檢查，如血常規(guī)、尿常規(guī)、糞便潛血檢查和腫瘤標(biāo)記物等生化檢查，以及初步的影像方法——B超、胸部X線等。若有必要，需要做更細(xì)致的特殊檢查，包括CT、MRI、內(nèi)鏡和PET-CT等。如果這些較深入的檢測(cè)方法證明腫瘤發(fā)生的可能性很大，則仍需要進(jìn)一步穿刺活檢。

圖2 臨床上腫瘤常規(guī)診療流程圖Fig.2 Flow chart of cancer clinical diagnosis

近年來，腫瘤生物標(biāo)記物的檢測(cè)成為腫瘤檢測(cè)的一大熱點(diǎn)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)和早期診斷方面都作出了巨大貢獻(xiàn)。生物學(xué)方面常用的技術(shù)有ELISA、2D-PAGE、多維蛋白質(zhì)識(shí)別技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)模式識(shí)別和蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)[19]。這些技術(shù)有的對(duì)于蛋白質(zhì)樣品需求量大，有的對(duì)腫瘤標(biāo)記物抗體的敏感性有高要求，更重要的是這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作者有較高的要求，且需要體積較大的輔助設(shè)備。

腫瘤影像檢測(cè)無論是在實(shí)驗(yàn)室研究還是臨床檢測(cè)方面都起到了不可或缺的作用。影像資料提供的信息，可以輔助醫(yī)生確定腫瘤的發(fā)生位置、大小、增殖和代謝等情況。過去的三十年，出現(xiàn)了大量的腫瘤分子影像檢測(cè)方法并且得以廣泛應(yīng)用[20]。這些方法包括超聲成像(ultrasonography)、光學(xué)成像、X線計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)、磁共振成象(MRI)、單光子發(fā)射斷層成像（SPECT）與正電子發(fā)射斷層成像(PET)等技術(shù)。近些年來，各種影像診斷技術(shù)已經(jīng)有很大的進(jìn)步，但在發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的同時(shí)仍存在難以克服的缺陷。

3.2 腫瘤檢測(cè)對(duì)象

腫瘤檢測(cè)大體上可以分為兩類：在體檢測(cè)和體外檢測(cè)。上文提到的影像技術(shù)大部分都是針對(duì)在體檢測(cè)，優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)無損檢測(cè)，但一般價(jià)格昂貴，病人只能到大型醫(yī)院檢查。體外檢測(cè)劃分種類較多，根據(jù)檢測(cè)對(duì)象不同，主要包括：穿刺活檢組織檢測(cè)、體液、排泄物和分泌物檢測(cè)等。其中體液檢測(cè)又包括血液、唾液、尿液的檢測(cè)。具體到實(shí)際檢測(cè)的物質(zhì)又分為基因、蛋白質(zhì)和細(xì)胞的檢測(cè)。外周循環(huán)血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells, CTC)與蛋白質(zhì)腫瘤生物標(biāo)記物用成熟的物理方法檢測(cè)較為簡(jiǎn)單，所以下文著重介紹這兩種物質(zhì)的檢測(cè)方法。已有研究表明，多種上皮腫瘤都會(huì)向循環(huán)系統(tǒng)中釋放CTC，如乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、直腸癌、宮頸癌和胰腺癌等。CTC可以提供有價(jià)值的臨床信息，包括腫瘤復(fù)發(fā)的早期檢測(cè)、監(jiān)測(cè)輔助治療的有效性和作為獨(dú)立的預(yù)后因素。當(dāng)上皮性腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)中，也許大多數(shù)人會(huì)認(rèn)為癌癥已發(fā)生了轉(zhuǎn)移，但實(shí)際并不總是這樣，例如，盡管有的乳腺癌患者出現(xiàn)CTC表明預(yù)后效果很差，但這不代表癌癥肯定發(fā)生了轉(zhuǎn)移[21]。在惡性轉(zhuǎn)移乳腺癌病人中CTC的數(shù)量若每7.5毫升超過5個(gè)癌細(xì)胞，則要比低于這一數(shù)值病人的生存率低很多[14]。病人所患癌癥為原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性，外周血中CTC含量的增加，表示有可能將發(fā)生轉(zhuǎn)移或得到很差的預(yù)后。CTC在血液中的含量十分微少，這就增加了檢測(cè)的難度。如下將介紹幾種目前分離CTC較有效的方法。

3.3 密度梯度離心

傳統(tǒng)方法通過密度梯度離心分離單核細(xì)胞。由于同類腫瘤細(xì)胞具有接近的浮力密度，且該浮力密度與血液中的其他血細(xì)胞不同，所以設(shè)置不同的濃度梯度，也可以將腫瘤細(xì)胞加以分離。接下來對(duì)分離的腫瘤細(xì)胞上的生物標(biāo)記物進(jìn)行免疫化學(xué)染色，在熒光顯微鏡下識(shí)別腫瘤細(xì)胞[22-24]。圖3為利用密度梯度離心原理，商業(yè)化分離血液中腫瘤細(xì)胞的方法——Oncoquick?[25]。該離心管具有一層多孔膜，管底部填充分離介質(zhì)，經(jīng)過離心后，密度較低的細(xì)胞，包括上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和血小板的細(xì)胞被分離到管的上部，大部分的淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞被分離到下層。這種方法操作簡(jiǎn)單，但腫瘤細(xì)胞可能會(huì)在血漿層有所殘留，而且可能被紅細(xì)胞等粘附，誤差較大。所以，僅靠此方法分離腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)準(zhǔn)確度較低，適合作為腫瘤細(xì)胞的初級(jí)分離。

圖3 Oncoquick?，商業(yè)化分離CTC的方法[25]Fig.3 Oncoquick?.a commercially available method to isolate CTC.

圖4 分離腫瘤細(xì)胞的微流體裝置[32](A)安裝在倒置顯微鏡上的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)；(B)微裝置的輪廓圖；(C)初過濾部分的放大照片，及細(xì)胞分離結(jié)構(gòu)的排布；(D)微流體的流體連接處。Fig.4 Microdevice for cancer cell isolation and enumeration.(A)Custom made experimental setup mounted on the inverted microscope.(B)Microdevice layout.(C)Enlarged view of pre- filters and arrays of cell isolation wells.(D)Fluidic connections to microdevice.

3.4 根據(jù)腫瘤細(xì)胞大小、剛度分離

腫瘤細(xì)胞與血液其他細(xì)胞的大小和剛度不同[26-27]，利用該物理性質(zhì)對(duì)血液中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離，是一種不需要標(biāo)記的、較有效的方法。早在1964年，Seal第一次提出利用過濾的方法可以將腫瘤細(xì)胞從外周血中分離出來[28]。血細(xì)胞的典型尺寸如下：紅細(xì)胞的直徑范圍為5～9 μm。早期研究表明，由于紅細(xì)胞的可變形性，當(dāng)濾孔直徑僅大于3.3 μm時(shí)，人體正常紅細(xì)胞即可以100%穿過[29]；粒性白細(xì)胞的直徑為10～15 μm；淋巴細(xì)胞的直徑為7～18 μm；單核細(xì)胞的直徑為12～20 μm[30]。而腫瘤細(xì)胞，如MCF-7的直徑約為22.5 μm，NCI-H358直徑約為18.1 μm，AGS直徑約為14.9 μm，LNCaP細(xì)胞系測(cè)量直徑為17±1.5 μm，大于大多數(shù)血細(xì)胞的直徑[31]。根據(jù)細(xì)胞直徑和剛度的不同，可以設(shè)計(jì)一定直徑的濾孔，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的分離。從各類細(xì)胞直徑數(shù)值可以看出，腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞的直徑數(shù)值有重疊處。為了解決這一問題，有的實(shí)驗(yàn)結(jié)合熒光染色的方法，或電裂解細(xì)胞后進(jìn)行PCR擴(kuò)增[31]等方法，區(qū)分這兩種細(xì)胞；而有的研究如圖4所示，通過白細(xì)胞變形能力強(qiáng)于腫瘤細(xì)胞，設(shè)計(jì)過濾缺口的方法進(jìn)行分離，初過濾部分缺口的長(zhǎng)度為20 μm，阻止細(xì)胞團(tuán)塊的進(jìn)入，相鄰分離層之間位移為25 μm，以此增加捕獲率。通過幾級(jí)篩孔的分離過濾，最終實(shí)現(xiàn)獲得腫瘤細(xì)胞的目的。這種方法對(duì)乳腺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞的分離效率可達(dá)80%[32]。一些利用生物標(biāo)記物進(jìn)行分離的方法，特異性不是很強(qiáng)，此時(shí)利用細(xì)胞的大小和變形性的分離方法就顯示出其優(yōu)勢(shì)。這種方法簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞傷害性小，且由于不需要被固定，可以利用分離的細(xì)胞進(jìn)一步研究。

3.5 抗原—抗體特異性結(jié)合分離法

雖然抗原抗體結(jié)合屬于化學(xué)反應(yīng)，目前大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的分離方法或多或少都會(huì)涉及到抗原抗體免疫性特異結(jié)合。該方法應(yīng)用廣泛，且已有大量的研究。目前，研究中應(yīng)用最成功的就是EpCAM，這種蛋白質(zhì)一般在正常細(xì)胞很少表達(dá)。在市場(chǎng)上，商業(yè)化的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的方法——CellSearch技術(shù)早已通過FDA認(rèn)可。它是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)CTC的檢測(cè)和計(jì)數(shù)的技術(shù)，可以用于監(jiān)測(cè)乳腺癌、直腸癌和前列腺癌等轉(zhuǎn)移癌癥病人的病情。其原理主要是利用連接EpCAM抗體的磁性珠子與腫瘤細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，通過免疫磁性分離。EpCAM在大多數(shù)的上皮腫瘤細(xì)胞表面有過量表達(dá)；CK在正常細(xì)胞的表達(dá)范圍在0%～20%[33]；但與血細(xì)胞相比缺乏CD45。因此，通過染色，若表型為EpCAM+、CK+、DAPI+、CD45-，則可確定為CTC。但由于腫瘤存在異質(zhì)性，CellSearch技術(shù)在多個(gè)研究報(bào)道中敏感性不一，降低了其在臨床的使用價(jià)值，仍需要進(jìn)一步研究。

圖5 分離全血中CTC的微流體裝置[34, 35]左：(A)分離CTC的工作站；(B)全血流經(jīng)微流體裝置；(C)蝕刻在硅上的帶有微柱的CTC芯片；(D)微流體裝置捕捉到的加入全血中的NCI-H1650肺癌細(xì)胞的電子掃描照片。右：在左圖芯片基礎(chǔ)上發(fā)展的新一代人字形芯片。Fig.5 Isolation of CTCs from whole blood using a micro fluidic device.Left: (A)The workstation setup for CTC separation.(B)The CTC-chip with microposts etched in silicon.(C)Whole blood flowing through the micro fluidic device.(D)Scanning electron microscope image of a captured NCI-H1650 lung cancer cell spiked into blood.Right: A new generation herring-chip developed on the basis of the device on the left.

Haber及其小組同樣利用EpCAM研究出一種分離CTC的微流體裝置（圖5），微流體裝置的微柱上固定有EpCAM抗體，實(shí)驗(yàn)通過控制流速和剪切力大小，將血液中的腫瘤細(xì)胞從血液富集到微流體芯片上。這種方法能從血液中近十億的血細(xì)胞中，分離出一個(gè)腫瘤細(xì)胞[34]。去年，該研究組重新改善這種微流體平臺(tái)，達(dá)到商業(yè)化規(guī)格，且細(xì)胞捕獲率也有所改善[35]。今年1月，有相應(yīng)醫(yī)療設(shè)備及診斷公司計(jì)劃與該團(tuán)隊(duì)合作，期待利用該方法研究出像家庭驗(yàn)孕這樣簡(jiǎn)單的早期診斷裝置[36]。不過，該方法雖然可以成功地將活的CTC成功分離出來，但是由于細(xì)胞固定在裝置上，很難再次選擇和利用。

有研究方法可以同時(shí)分離兩種生物標(biāo)記物——PSA和CA15-3[15]，PSA是前列腺癌的生物標(biāo)記物，CA15-3主要檢測(cè)乳腺癌。該方法能夠釋放結(jié)合了抗體的腫瘤生物標(biāo)記物，并利用納米傳感器定量檢測(cè)。免疫特異性結(jié)合分離的方法，主要是利用腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)不同，實(shí)驗(yàn)研究常用腫瘤生物標(biāo)記物的抗原分離腫瘤細(xì)胞，表2中各腫瘤類型對(duì)應(yīng)的標(biāo)記物可用來檢測(cè)該疾病，且分別已有大量研究?？乖贵w特異性結(jié)合的檢測(cè)原理一般不作為單獨(dú)的檢測(cè)手段，而是作為其他檢測(cè)手段的一種輔助檢測(cè)方法。

3.6 電學(xué)方法

圖6 細(xì)胞在介電親和性通道內(nèi)流動(dòng)過程受力情況。重力(FG)，介電力(FDEPx ，F(xiàn)DEPy)，流體動(dòng)力水平阻力(Fdrag)和浮力(FLift)Fig.6 Forces affecting cells within the dielectric affinity column: gravity(FG),dielectrophoresis(FDEPx, FDEPy), fluid drag(Fdrag)and hydrodynamic lift effects(FLift).

圖7 根據(jù)介電性質(zhì)分離腫瘤細(xì)胞[44]Fig.7 Isolating tumor cells by dielectrophoresis.

腫瘤細(xì)胞是變異了的正常細(xì)胞，電學(xué)性質(zhì)方面也會(huì)有所差異。在當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，毫米或納米級(jí)顆粒介電性的研究引起廣泛關(guān)注。有研究對(duì)淋巴瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的阻抗進(jìn)行測(cè)量，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來評(píng)價(jià)細(xì)胞的介電性，發(fā)現(xiàn)較低的特異性膜電容是惡性腫瘤顯著的特點(diǎn)，行波介電泳的頻率在1 MHz以上可實(shí)現(xiàn)這兩種細(xì)胞的分離，并保持這兩種細(xì)胞的活性[37]。細(xì)胞電荷性質(zhì)的特異性不足以在不同的細(xì)胞混合物中作為區(qū)分方法，所以采用介電泳方法。介電泳方法通過改變電場(chǎng)激發(fā)微電極，從而吸引或排斥細(xì)胞，不同形態(tài)、大小的細(xì)胞在分離過程中受到介電力作用，電場(chǎng)的變化改變細(xì)胞整體受力情況[38～40]，如圖6所示。有很多研究利用介電泳的方法對(duì)不同的細(xì)胞進(jìn)行分離，同樣這一方法也被用來分離腫瘤細(xì)胞，有研究者已成功將乳腺癌細(xì)胞同血液中其他細(xì)胞分離開來[41～43]。如圖7所示，分離過程中，在一定的流速下，細(xì)胞在入口處低頻電信號(hào)的作用下受到排斥的介電泳作用力，防止細(xì)胞下沉并粘附在平面上；隨著細(xì)胞的流動(dòng)，電極激發(fā)頻率增加，浮力減小，細(xì)胞在對(duì)應(yīng)其介電特性的位置下沉停滯下來。該方法根據(jù)不同形態(tài)細(xì)胞的介電性質(zhì)，在不同的頻率下，細(xì)胞粘附在通道的特定位置上，以此將腫瘤細(xì)胞分離。腫瘤細(xì)胞的分離頻率為40～60 kHz，這一部分的細(xì)胞依據(jù)它們是否在分裂期、細(xì)胞大小和復(fù)雜度來分離。受損的腫瘤細(xì)胞分離頻率為60～120 kHz，粒細(xì)胞為70～90 kHz，淋巴細(xì)胞為85～105 kHz，紅細(xì)胞分離頻率為大于140 kHz[44]。介電泳分離方法雖然簡(jiǎn)單，但不同種類的腫瘤細(xì)胞的介電性質(zhì)存在差異，對(duì)應(yīng)的電信號(hào)頻率也不同，僅就此而言，這種方法存在一定的局限性。循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中的相對(duì)數(shù)量十分稀少，檢測(cè)效率較低。介電泳方法為腫瘤細(xì)胞的分離方法，不進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，為了確保細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞還要進(jìn)一步的病理檢測(cè)，并與其他細(xì)胞計(jì)數(shù)方法聯(lián)合使用。例如有研究者利用單克隆抗體將CTC富集在微流體芯片上，通過電導(dǎo)率的方法對(duì)捕獲的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)等[45-46]。

圖8 整體系統(tǒng)方案設(shè)計(jì)[47]Fig.8 Schematic design of the integrated system.

阻抗檢測(cè)也是一種常見的測(cè)量方式。圖8是一種測(cè)量CTC的半集成電學(xué)生物傳感器[47]。腫瘤細(xì)胞樣品先經(jīng)過免疫磁珠和過濾進(jìn)行初分離，然后導(dǎo)入微芯片進(jìn)一步免疫化學(xué)富集，通過阻抗譜學(xué)實(shí)現(xiàn)電子檢測(cè)。這一方法不需要抗體標(biāo)記、熒光染色，也不需要影像分析。斯坦福大學(xué)的研究者們用阻抗法對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞的分離均進(jìn)行過研究。他們通過設(shè)計(jì)微流道的方法，在微流道內(nèi)固定與被檢測(cè)體可以特異性結(jié)合的物質(zhì)，其他未結(jié)合的物質(zhì)將被沖洗掉，測(cè)量微通道的電阻，從而確定是否存在被檢測(cè)物質(zhì)，被檢測(cè)物質(zhì)的數(shù)量，同時(shí)起到分離的作用[48～50]。

除此之外，電學(xué)性質(zhì)的改變還可以通過檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的電容性刻畫[51]。從Mirsky 1997年的工作開始，電容方法測(cè)量化學(xué)、生化反應(yīng)得以發(fā)展[52]。通過電學(xué)方法檢測(cè)的重點(diǎn)是提高檢測(cè)敏感度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。如果要發(fā)展電學(xué)檢測(cè)腫瘤這一技術(shù)，那么提高這些標(biāo)準(zhǔn)是必經(jīng)之路。

3.7 光學(xué)檢測(cè)方法

光學(xué)方法檢測(cè)是生物學(xué)上常用的檢測(cè)方法，包括熒光、干涉、熱透鏡、表面離子共振和化學(xué)發(fā)光等。這些方法已在一些生物、化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)上得到實(shí)現(xiàn)，其檢測(cè)原理及特異性，在腫瘤檢測(cè)上也發(fā)揮著重要作用。對(duì)于熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，自動(dòng)數(shù)字顯微鏡(ADM)可作為一種可靠的檢測(cè)手段[53-54]，檢測(cè)率可以達(dá)到每秒800個(gè)細(xì)胞。但對(duì)于血液中大量的細(xì)胞而言，這種速度是不夠的。Krivacic等人選擇一種光纖陣列掃描技術(shù)(FAST)，其檢測(cè)率是ADM的500倍，且具有較高的敏感性，特異性也有所提高[55]。微流體技術(shù)的發(fā)展，為光學(xué)檢測(cè)提供了便利。集成化的微流體光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，在一定意義上簡(jiǎn)化了整個(gè)光學(xué)檢測(cè)過程。

3.8 其他腫瘤檢測(cè)新方法

圖9 μN(yùn)MR臨床分析系統(tǒng)[56](A)病人床邊完整μN(yùn)MR系統(tǒng)；(B)操作μN(yùn)MR系統(tǒng)的智能手機(jī)界面；(C)內(nèi)置微磁體的μN(yùn)MR探針；(D)對(duì)病人穿刺獲得細(xì)胞的生物處理。Fig.9 The μN(yùn)MR clinical analysis system.(A)Complete μN(yùn)MR system for use at the patient′ s bedside.(B)Smart phone interface for operating the μN(yùn)MR system.(C)State-of-the-art μN(yùn)MR probe used for sensing with the mini magnet.(D)Fine-needle aspirates from each patient sample were processed.

腫瘤檢測(cè)是目前臨床檢測(cè)的熱點(diǎn)。近年來，一些獨(dú)特、創(chuàng)新且優(yōu)勢(shì)突出的檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)。美國麻省總醫(yī)院的研究者們發(fā)明了一種利用微型NMR快速、多參數(shù)檢測(cè)人類腫瘤細(xì)胞的方法[56]。圖9所示為實(shí)現(xiàn)該檢測(cè)方法的系統(tǒng)。容易看出其簡(jiǎn)單、易操作性體現(xiàn)在裝置的小型化，僅手機(jī)系統(tǒng)就可達(dá)到控制裝置和輸出結(jié)果的效果。該小組實(shí)現(xiàn)了對(duì)來自50個(gè)病人活體穿刺組織的臨床分析，并通過其他20位病人驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。僅生物穿刺就可以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)60分鐘內(nèi)對(duì)9種蛋白質(zhì)標(biāo)記物的分析。除此之外，該小組通過此技術(shù)對(duì)四種蛋白質(zhì)標(biāo)記物定性定量檢測(cè)，在腫瘤診斷中達(dá)到96%的準(zhǔn)確率，優(yōu)于目前傳統(tǒng)免疫化學(xué)臨床分析結(jié)果。研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)隨著時(shí)間很快就會(huì)降解，這也就要求有快速的檢測(cè)過程，最好可以在病患的床邊檢測(cè)。由于蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的原因，對(duì)于不同的病人即使是同一種腫瘤都具有異質(zhì)性，這就對(duì)分子診斷和藥物靶向治療有很大的影響。該研究提出的這種定性的point-of-care微NMR技術(shù)在腫瘤的臨床檢測(cè)方面具有較大潛力。

3.9 結(jié)合納米技術(shù)的腫瘤檢測(cè)

納米技術(shù)是近年來出現(xiàn)的高新技術(shù)，在過去的幾年里得到了飛速發(fā)展，已成功應(yīng)用到許多領(lǐng)域，包括醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)及制造業(yè)等。納米顆粒具有獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、化學(xué)、機(jī)械和物理性質(zhì)，這在解決醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的難題上起到了巨大的促進(jìn)作用。納米材料根據(jù)材質(zhì)和形狀不同可分為很多種，如金納米顆粒、磁納米顆粒、碳納米管、納米孔和微懸臂等。不同的納米顆粒具有不同的特性，因此應(yīng)用的范圍也有所差異。

金納米顆粒由于其生物光學(xué)特性，在腫瘤細(xì)胞檢測(cè)過程中，與腫瘤細(xì)胞相連，可作為光學(xué)標(biāo)記物。金納米顆粒膜電極在腫瘤生物標(biāo)記物的檢測(cè)過程中也起到一定作用。腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)不強(qiáng)，利用金納米顆?？梢詫?shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。腫瘤病人和健康人的呼吸成分有所不同，據(jù)此進(jìn)行診斷肺癌的研究。Peng等設(shè)計(jì)了9個(gè)交叉反應(yīng)的化學(xué)阻抗傳感器陣列，每一個(gè)傳感器都能通過呼吸監(jiān)測(cè)肺癌的方法檢測(cè)到多種氣體物質(zhì)。這種化學(xué)阻抗傳感器采用不同有機(jī)修飾的5 nm的金納米顆粒。對(duì)于肺癌標(biāo)記物，傳感器反應(yīng)靈敏，并且可檢測(cè)多種濃度[57]。被檢測(cè)的生物顆粒與固體界面的接觸是很重要的，只有足夠的接觸才能達(dá)到足夠的結(jié)合，有研究者利用碳納米管，在芯片內(nèi)建造碳納米管“森林”，從而提高了微量檢測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)效率[58]，充分利用了碳納米管的尺寸和物理特性。

納米孔內(nèi)連接對(duì)應(yīng)腫瘤標(biāo)記物的抗體，當(dāng)腫瘤標(biāo)記物通過納米孔，抗原抗體特異性結(jié)合，則引起阻抗的改變，檢測(cè)阻抗的變化可確定腫瘤標(biāo)記物的濃度[59]。鑒于納米材料的優(yōu)點(diǎn)，未來研究中應(yīng)用納米顆粒到檢測(cè)中，在提高檢測(cè)敏感性等方面仍值得挖掘。

4 腫瘤檢測(cè)面臨的問題與未來發(fā)展

如上所述，關(guān)于腫瘤檢測(cè)的研究新的方法層出不窮，可喜進(jìn)展。雖然它們各自具有獨(dú)特的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，但仍暴露出一些問題，影響腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)準(zhǔn)確度、敏感性和特異性等結(jié)果。大量的研究根據(jù)腫瘤的上皮抗原進(jìn)行分離，并且認(rèn)為EpCAM是目前最優(yōu)的腫瘤生物標(biāo)記物，但有研究表明大多數(shù)惡性腫瘤的CTC會(huì)丟失上皮抗原。這就意味著這種方法有可能會(huì)漏檢具有侵害性的CTC。事實(shí)上，研究發(fā)現(xiàn)134種組織類型不同的腫瘤細(xì)胞只有70%表達(dá)EpCAM[60]。一些抗原抗體在沒有進(jìn)行孵育的情況下很難反應(yīng)，導(dǎo)致低敏感性和假陽性[61]。目前，尚沒有一種100%特異性的腫瘤生物標(biāo)記物。腫瘤細(xì)胞體積小、數(shù)量稀少，與正常細(xì)胞的整體差異不是特別明顯，且不同部位的腫瘤及不同病人的同部位腫瘤的性質(zhì)也可能有所不同，這都增加了檢測(cè)的難度，它們恰恰是未來需要解決的。

從目前對(duì)腫瘤檢測(cè)裝置的研發(fā)趨勢(shì)來看，人們?cè)絹碓絻A向于將檢測(cè)裝置予以微型化，微流體芯片就是其中頗具代表性的成果。此外，其他領(lǐng)域新技術(shù)的出現(xiàn)，也會(huì)帶動(dòng)腫瘤檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是傳感器、納米技術(shù)等的介入更是如此。當(dāng)然，如今應(yīng)用于其他領(lǐng)域而同樣適用于腫瘤檢測(cè)的物質(zhì)、方法或裝置尚未被發(fā)現(xiàn)，這也是有待探索的一個(gè)方向?？傮w上，不局限于現(xiàn)有技術(shù)，充分地將多種在各自方面效能突出的方法結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)多模式的綜合檢測(cè)，不增加整個(gè)過程的復(fù)雜程度，完成高效、準(zhǔn)確、低成本的檢測(cè)過程是未來的研究重點(diǎn)。

5 小結(jié)

腫瘤早期檢測(cè)長(zhǎng)期困擾著致力于該領(lǐng)域的研究者們。本文深入討論了該領(lǐng)域的最新進(jìn)展，可以看到，大部分檢測(cè)過程并不限于采用一種方法。例如，有些方法是通過密度梯度離心、電泳、抗原抗體、過濾等單一途徑分離腫瘤細(xì)胞，然后再結(jié)合其他電學(xué)、化學(xué)、光學(xué)方法來確定腫瘤細(xì)胞數(shù)量。但在分離腫瘤細(xì)胞的過程中，單一方法有缺陷，需要多種方法結(jié)合才能準(zhǔn)確分離腫瘤細(xì)胞，所以實(shí)驗(yàn)的研究定位在腫瘤的多模式檢測(cè)上。目前應(yīng)用于臨床的腫瘤細(xì)胞分離方法幾乎都不成熟，從這方面來講，過往的研究方法仍需要改進(jìn)，特別是新的檢測(cè)理念和方法在未來的研究中至關(guān)重要。為了更簡(jiǎn)單的實(shí)現(xiàn)腫瘤分離，在研究過程中應(yīng)將多種物理檢測(cè)方法加以結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多模式的檢測(cè)。研究方法的組合，可以起到一加一大于二的效果，也令整個(gè)過程更加準(zhǔn)確。該領(lǐng)域的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)將腫瘤發(fā)現(xiàn)于早期，并予以及時(shí)治療，從而緩解乃至解決這一人類所面臨的重大難題。

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