雷程紅，趙文年，樊紅春，龔曉偉，李新鵬，馬 林

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

犬細(xì)小病毒性腸炎，以劇烈嘔吐、腹瀉和白細(xì)胞顯著減少為其臨床特征，病初發(fā)熱，精神沉郁，不食，嘔吐，腹瀉，隨著病情的發(fā)展，糞便由稀狀變?yōu)榭Х壬蚍厌u色樣的血便并帶有特殊的腥臭氣味。該病發(fā)病率高，如果得不到正確診斷和及時治療，死亡率也高。最近，烏魯木齊市寵物犬發(fā)生疑似細(xì)小病毒性腸炎流行，我們結(jié)合臨床表現(xiàn)，采用兩種方法對該病進(jìn)行了診斷，并對這兩種方法做了比較。

1 材料與方法

1.1 材料 病料，采集以嘔吐、腹瀉為臨床表現(xiàn)的寵物犬的糞便，共68例。豬紅細(xì)胞，采集6～8月齡健康豬全血。犬細(xì)小病毒單克隆抗體，購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司。犬細(xì)小病毒檢測試紙，購自韓國安捷公司。96孔90°V型微量反應(yīng)板，微量加樣器和吸頭，1.5mL離心管，微量振蕩器，常用冰箱，溫箱，搖床，離心機。

1.2 方法

1.2.1 檢測試紙法 按照說明書進(jìn)行，即：用棉簽收集犬糞，將棉簽浸入裝有1mL反應(yīng)緩沖液的樣品收集管中，充分混勻，將混合液4滴緩慢地加到試紙上的樣品孔中，5～10min內(nèi)判定結(jié)果。

1.2.2 HA－HI法

1.2.2.1 糞便處理 用棉簽收集犬糞，放入無菌的裝有1mL生理鹽水的小離心管內(nèi)，反復(fù)涮洗幾次后棄去棉簽。將糞便樣品反復(fù)凍融3次，13000r／min離心10min，吸取上清液放入另一無菌小離心管內(nèi)，加入1／10體積的氯仿抽提混勻，3000r／min離心10min，液體分為兩層，小心吸取上層液體即為待檢樣品，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.21 %豬紅細(xì)胞懸液制備 無菌采集豬全血放入阿氏液中，血與阿氏液的比例為1∶9，迅速輕輕混勻，用10～20倍的生理鹽水洗滌3～4次，每次2000r／min離心5min，再用0.2mol／L，pH 值7.2的PBS洗滌1次，2000r／min離心5min。棄上清液體，用0.2mol／L，pH 值7.2的PBS將紅細(xì)胞配制成1%豬紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 醛化紅細(xì)胞制備 見郭鑫［1］和符子華［2］的方法。

1.2.2.4 HA－HI方法 見秦海斌等人［3］的方法。即：在96孔板中進(jìn)行操作。用生理鹽水倍比稀釋處理好的糞便樣本25μL至第11孔，第12孔做陰性對照，每孔加1%豬紅細(xì)胞懸液25μL，振蕩混勻后4℃靜置3h后讀取結(jié)果。以使豬紅細(xì)胞100%凝集的最高稀釋倍數(shù)為樣本中病毒液的紅細(xì)胞凝集效價。以該凝集效價配4單位病毒，用生理鹽水稀釋犬細(xì)小病毒單克隆抗體25μL至第10孔，第11孔做紅細(xì)胞對照，第12孔做抗原對照，加4單位病毒25μL，振蕩混勻之后放置37℃溫箱作用30min，每孔加入1%豬紅細(xì)胞懸液25μL，振蕩混勻后4℃靜置3h后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙法的檢測結(jié)果 檢測的68例糞樣均為陽性，即68例病犬都是犬細(xì)小病毒性腸炎。

2.2 HA－HI的結(jié)果 68個樣本中，63個的效價大于或等于1∶16且能被犬細(xì)小病毒單克隆抗體所抑制，為陽性，其余5個為陰性，陽性率為92.6%。檢測結(jié)果見表1。

表1 檢測試紙法和HA－HI診斷犬細(xì)小病毒結(jié)果

2.3 兩種方法的比較 從檢測結(jié)果看，試紙法的敏感性比HA－HI高，但特異性低；HA－HI的特異性高但敏感性低，兩者的陽性符合率為92.6%。

3 討論

3.1 試紙法是目前寵物門診最常采用的診斷方法［4］，其原理是免疫層析，即待檢糞樣（抗原）加到試紙條一端的樣本墊上，通過毛細(xì)作用向前移動，遇到結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體后互相反應(yīng)，再移動至固定的抗體區(qū)域與之結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，出現(xiàn)肉眼可見的顯色結(jié)果。該法敏感性高、簡單快速方便。我們用該法診斷68例病犬，其結(jié)果全部為細(xì)小病毒病，這與發(fā)病犬的臨床表現(xiàn)基本相符。

3.2 HA－HI是檢測犬細(xì)小病毒病的國標(biāo)方法［5］，其原理是犬細(xì)小病毒有凝集豬紅細(xì)胞的能力，這種凝集能力又可被犬細(xì)小病毒特異性抗體所抑制。該法特異性高。我們用該法診斷68例病犬，其結(jié)果是63例為細(xì)小病毒病，這與發(fā)病犬的臨床表現(xiàn)也相符。

3.3 兩種方法的檢測結(jié)果中有5例結(jié)果不相符，其原因何在？分析試紙法，其假陽性是人為因素或是試紙本身造成國內(nèi)有關(guān)這方面的報道很少，我們對這不相符的5例糞便采用離心處理后又用試紙法檢測1次，結(jié)果4例為陰性，1例仍然是陽性。這說明造成假陽性結(jié)果的原因可能是糞便中的其他成分與試紙中抗體發(fā)生非特異性結(jié)合所致。分析HA－HI，其假陰性可能與腸道內(nèi)出現(xiàn)犬細(xì)小病毒抗體有關(guān)［6－7］，也可能與樣品的處理、操作及加樣的準(zhǔn)確、器材的干凈、溶液的無菌等多種人為因素有關(guān)［1］。

3.4 上述兩種方法在臨床診斷中各有優(yōu)缺點，從快速簡便來看，選擇試紙法較好，因為試紙法操作步驟少，耗時幾分鐘，而在HA－HI試驗中，步驟多，耗時3～4h，且新鮮紅細(xì)胞需要不斷采集和制備，很不方便；從結(jié)果的準(zhǔn)確性看，選擇HA－HI方法較好，因為該法的特異性比試紙法的要高。

4 結(jié)語

4.1 這次在寵物犬中流行的是犬細(xì)小病毒性腸炎。

4.2 HA－HI方法檢測時間較長，影響因素比較多，但經(jīng)濟(jì)實惠；目前門診上普遍采用的試紙法，方便快捷，只要對糞便事先處理，其假陽性會降低。

4.3 要得到準(zhǔn)確的臨床診斷結(jié)果，最好同時采用這兩種方法來互補。

［1］ 郭鑫.動物免疫學(xué)實驗教程［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007：55.

［2］ 符子華.用醛化豬紅細(xì)胞進(jìn)行犬細(xì)小病毒HA和HI試驗［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1993（3）：133－134.

［3］ 秦海斌，張匯東，繆勤，等.犬細(xì)小病毒血凝的檢測和血凝抑制試驗方法的優(yōu)化［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（7）：49－52.

［4］ 吳潔，劉強，侯宇成，等.新疆石河子市犬細(xì)小病毒病流行病學(xué)調(diào)查［J］.北京農(nóng)業(yè)，2011（15）：80－82.

［5］ 史利軍，曾妮，李剛.犬細(xì)小病毒生物學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（4）：82－85.

［6］ 夏咸柱，李六金，武德麗，等.犬細(xì)小病毒性腸炎的診斷研究－犬細(xì)小病毒血凝和血凝抑制試驗［J］.中國人民解放軍獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1983，3（2）：144－148.

［7］ 賈補年.犬細(xì)小病毒的電鏡和免疫電鏡觀察［J］.家畜傳染病，1983（3）：11－13.