秦海燕，葉 平，白鳳相，索志榮

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學(xué)分析測(cè)試中心，四川 綿陽 621010）

桉葉油是桉樹葉油腺細(xì)胞分泌的一種植物精油，藥理試驗(yàn)表明，桉葉油具有抗菌消炎作用［1］，被廣泛用于治療肺結(jié)核，糖尿病，哮喘，也用作消毒劑，抗氧化劑和抗菌劑，尤其在上呼吸道感染疾病的治療上表現(xiàn)頗佳［2］。關(guān)于桉葉油的抑菌活性已有較多研究［3－4］，但以桉葉油為抗菌活性物質(zhì)制作成固體栓劑用于動(dòng)物肺炎的恢復(fù)治療未見文獻(xiàn)報(bào)道。當(dāng)前，養(yǎng)殖場(chǎng)由于養(yǎng)殖動(dòng)物密度大，空氣流通不暢，上呼吸道感染成為養(yǎng)殖場(chǎng)中極為常見的疾病，其中尤以豬細(xì)菌性肺炎居多［5］，養(yǎng)殖戶用藥種類增多，劑量加大，但用藥效果卻越來越不理想，導(dǎo)致抗生素濫用日益嚴(yán)峻，間接地危害人類健康。本試驗(yàn)建立了小鼠肺炎模型，將桉葉油制成固體栓劑，利用栓劑中桉葉油自然揮發(fā)的特性，通過動(dòng)物試驗(yàn)研究桉葉油對(duì)肺炎小鼠的治療作用。該試驗(yàn)為解決現(xiàn)代化養(yǎng)殖場(chǎng)中動(dòng)物上呼吸道感染的預(yù)防與治療以及緩解抗生素濫用的問題提供了簡(jiǎn)單、便捷、無副作用的給藥途徑。

1 儀器與材料

超凈工作臺(tái)、恒溫生化培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、接種針、1mL注射器、瓊脂、吐溫－80、山梨酸鉀、瓊脂營(yíng)養(yǎng)粉、75%酒精、乙醚等。桉葉油（醫(yī)藥級(jí)），購(gòu)自鄭州藍(lán)宇化工有限公司。保護(hù)傘（治療豬肺炎，編號(hào)：31915143217），購(gòu)自成都福臨生物技術(shù)公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：18～22g雌雄小鼠，Ⅱ級(jí)，購(gòu)自成都市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配送中心。

2 方法

2.1 制備桉葉油固體栓劑 取瓊脂4g溶于97 mL蒸餾水，加熱至沸騰，維持10min，待混合物冷卻至60℃，迅速加入山梨酸鉀1g，10mL桉葉油及6mL吐溫－80，并沿一個(gè)方向不斷攪拌使其完全乳化，接著沿玻璃棒傾倒至栓劑模型盒內(nèi)，待其完全冷卻即得桉葉油固體栓劑。

2.2 肺炎病原菌的接種及分離培養(yǎng) 在綿陽某豬場(chǎng)，選取有嚴(yán)重肺炎癥狀的病豬，宰殺后取其肺部，自來水沖洗至表面無血水，75%酒精表面消毒備用，于超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌操作挑取肺部的膿點(diǎn)接種于培養(yǎng)基，在生化培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)2d。再挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基，直至獲得純培養(yǎng)。

2.3 小鼠肺炎模型的建立

2.3.1 肺炎菌懸液的制備 刮取純培養(yǎng)培養(yǎng)皿內(nèi)一定數(shù)目的特征菌落，置于10mL生理鹽水中，搖勻，制作成3種不同濃度的菌懸液，經(jīng)試驗(yàn)2個(gè)／mL菌落為建立小鼠肺炎模型的適合病菌濃度。

2.3.2 穿刺肺葉建立小鼠肺炎模型 取小鼠1只，用乙醚麻醉使其輕度昏迷，仰臥固定；用1mL注射器取b菌液0.05mL，用手觸摸小鼠腹部，在小鼠左下腹部找到最后肋骨，從下至上，摸至左側(cè)第3～4根肋骨之間；進(jìn)針穿過胸腔，刺入肺小心推注。注射完成后，將小鼠置于籠內(nèi)觀察4h，無明顯異狀，則建模成功。

2.4 桉葉油固體栓劑藥效試驗(yàn) 為排除試驗(yàn)過程中偶然誤差的影響，本試驗(yàn)共做3批，第1批：取22只小鼠，用2.3.2方法使小鼠感染肺炎病菌。將已成功建立肺炎模型的小鼠隨機(jī)分成3組，桉葉油組8只，在圈養(yǎng)小鼠籠上放置桉葉油固體栓劑，空白對(duì)照組6只，籠上不放置任何東西；保護(hù)傘藥物對(duì)照組8只，在圈養(yǎng)小鼠籠上放置金鐘罩固體栓劑，飼養(yǎng)籠分別放于不同的房間。小鼠以專用飼料喂養(yǎng)，自由采食飲水，室溫適宜。第2批、第3批小鼠分組及藥效試驗(yàn)同第一批。給藥方式均為空氣給藥。

3 結(jié)果與討論

桉葉油固體栓劑藥效試驗(yàn)結(jié)果與分析 給藥后，觀察小鼠生理、活動(dòng)情況并記錄，每日2次。小鼠在感染肺炎病菌后的第1、2天均表現(xiàn)精神沉郁，活動(dòng)量明顯下降，食欲不振等，從第3天開始桉葉油組和金鐘罩組有部分小鼠出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，并在7d之后生理、活動(dòng)情況正常，但空白對(duì)照組死亡情況較為嚴(yán)重。桉葉油組、金鐘罩組和空白對(duì)照組的小鼠死亡情況見表1。

由表1可知：同一組別不同批次的數(shù)據(jù)波動(dòng)平穩(wěn)，表明本試驗(yàn)重復(fù)性較好，且桉葉油組和保護(hù)傘組每一批次的小鼠死亡率均低于空白對(duì)照組，桉葉油組平均死亡率為58%，空白對(duì)照組平均死亡率為89%，桉葉油組與空白對(duì)照組差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)桉葉油固體栓劑能夠自然揮發(fā)。與空白對(duì)照組相比，桉葉油使肺炎小鼠存活率提高31%。

表1 小鼠死亡情況及死亡率

剖檢觀察健康小鼠其肺組織顏色淡白、彈性良好；空白對(duì)照組死亡小鼠肺組織為淡紅色至深紅色，可見肺組織出血點(diǎn)并伴有腫脹、彈性差；以桉葉油固體栓劑治療且2周后未死亡的小鼠肺部呈灰白色、彈性良好，其他無明顯病變特征。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，桉葉油固體栓劑對(duì)肺炎小鼠具有恢復(fù)治療作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)開發(fā)了一種新劑型－固體栓劑，并成功將桉葉油加入到固體栓劑中，使桉葉油能夠持續(xù)、均勻向空氣中散發(fā)，發(fā)揮其抑菌殺菌活性，在成功建立小鼠肺炎模型的基礎(chǔ)上，桉葉油以小鼠自然呼吸的方式用于肺炎小鼠的恢復(fù)性治療，小鼠平均存活率提高了31%，顯示桉葉油對(duì)肺炎小鼠具有恢復(fù)治療作用。將桉葉油制成固體栓劑用于養(yǎng)豬場(chǎng)不僅使用方便，且能勻速持久地向空氣中釋放出幽雅的清香氣味，對(duì)大、小型養(yǎng)豬場(chǎng)在預(yù)防及治療豬呼吸道疾病方面具有良好的應(yīng)用前景。

［1］ 田玉紅，張祥民，黃泰松，等.桉葉油的研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（10）：139－143.

［2］ Aihua Song，Ying Wang，Yanmei Liu.Study on the chemical constituents of the essential oil of the leaves of Eucalyptus globulus Labill from China［J］.Asian Journal of Traditional Medicines，2009，4（4）：134－140.

［3］ 楊致年，曾超，朱宗良，等.植物精油的抗菌性［J］.四川林業(yè)科技，2000，21（3）：37－39.

［4］ 黃瑤，田玉紅，劉雄民，等.尾葉桉葉精油的成分分析及抑菌效果初探［J］.北方園藝，2010（6）：26－28.

［5］ 白淑民.豬傳染性胸膜肺炎病的防治研究進(jìn)展［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，1999，5：30－33.