曾祥偉，徐亞萍，李志軍，李夢(mèng)溪

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

雞傳染性囊病是由傳染性囊病病毒（IBDV）引起的幼雞的一種急性、高度接觸性傳染病。傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引發(fā)的雞的一種急性、高接觸性的呼吸道和泌尿生殖道疾病。這兩種病毒性疾病一直是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病，主要依靠接種疫苗進(jìn)行防控。然而，隨著這兩種病毒的不斷變異，疫苗接種也不能達(dá)到理想的保護(hù)效果。近兩年來(lái)，黑龍江地區(qū)的一些養(yǎng)殖場(chǎng)多次發(fā)生了IBDV和IBV混合感染，導(dǎo)致大批幼齡雞只發(fā)病死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，本試驗(yàn)將從當(dāng)?shù)胤蛛x的這兩種疫病流行毒株制作成油佐劑滅活疫苗，對(duì)剛開(kāi)產(chǎn)的蛋雞進(jìn)行多次加強(qiáng)免疫，制備抗IBDV－IBV二聯(lián)高免卵黃抗體，嘗試對(duì)當(dāng)?shù)匕l(fā)生的疫情進(jìn)行有效控制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 30只20周齡健康的海賽克斯蛋雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)提供，它們均經(jīng)過(guò)了IBD、IB的常規(guī)基礎(chǔ)免疫。

1.2 主要試劑 IBD瓊擴(kuò)標(biāo)準(zhǔn)抗原、IBD瓊擴(kuò)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，雞傳染性支氣管炎凝集抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。Span白油、甲醛、氯仿等，購(gòu)自哈爾濱聯(lián)星生物公司。

1.3 IBD、IB油佐劑滅活疫苗 現(xiàn)場(chǎng)采集的已確診為IBD的典型病雞的新鮮腔上囊，與生理鹽水按1∶5比例勻漿，反復(fù)凍融3次，3000r／min離心30 min，取上清用甲醛滅活，并配以油佐劑制成滅活苗。將從當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)分離的IBV接種10日齡雞胚尿囊腔，37℃培養(yǎng)36～40h，收集尿囊液，經(jīng)甲醛滅活后加油佐劑，制成油乳劑滅活苗。

1.4 免疫方法 用制備好的IBD油乳劑滅活苗和IB油乳劑滅活疫苗對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行分別肌肉注射，每種疫苗的接種劑量為2mL／只，每間隔10d，以油乳劑滅活苗分別做3次加強(qiáng)免疫，劑量同上。此后定期檢測(cè)卵黃抗體的水平，待抗IBDV瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶128以上，抗IBV的Hl效價(jià)達(dá)1∶1024以上時(shí)開(kāi)始收集高免蛋，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。瓊擴(kuò)效價(jià)降低到1∶64，Hl效價(jià)降低到1∶512時(shí)停止收蛋，再進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.5 卵黃抗體的制備 收集的高免蛋先用自來(lái)水將蛋表面沖洗干凈，再放入0.5%新潔爾滅溶液中浸泡消毒，然后取出用酒精棉擦拭蛋殼，打開(kāi)蛋殼，無(wú)菌分離蛋黃，加入滅菌生理鹽水做適量稀釋。再以氯仿為溶劑與卵黃生理鹽水等量混合，室溫下放置6h以上，期間振蕩2～4次，使其充分溶解。2000r／min離心20min，收集上清。最后按每mL加入青霉素1000IU、鏈霉素1000μg，并按總量的0.01%加入硫柳汞防腐，經(jīng)雙層滅菌紗布過(guò)濾，即為制備的卵黃抗體。

1.6 無(wú)菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn) 取高免卵黃抗體0.2 mL，分別接種于鮮血瓊脂平板、馬丁肉湯和厭氣肉肝湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。用14日齡健康雛雞10只，各皮下注射本品10mL。觀察10d，記錄雛雞的健康和存活情況。

1.7 效價(jià)測(cè)定 取待檢卵黃抗體液，以瓊脂擴(kuò)散法（AGP）檢測(cè)抗IBDV抗體效價(jià)；以血凝和血凝抑制試驗(yàn)（HA－HI）檢測(cè)抗IBV抗體效價(jià)。

1.8 臨床應(yīng)用試驗(yàn) 哈爾濱市郊的某養(yǎng)禽場(chǎng)發(fā)生了疫情，死亡幼雞100多只，經(jīng)臨床剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷，結(jié)果為IBDV、IBV混合感染。選取出現(xiàn)發(fā)病癥狀的雞120只，隨機(jī)分成兩組。一組用制備的抗IBDV－IBV二聯(lián)卵黃抗體以肌肉注射進(jìn)行治療，每天2次，連續(xù)治療1周；另一組按照以往的治療方法進(jìn)行處理，病毒唑加抗生素肌肉注射，每天2次，連續(xù)治療1周。對(duì)沒(méi)有出現(xiàn)癥狀的雞同時(shí)注射該二聯(lián)卵黃抗體進(jìn)行預(yù)防，每天1次，連續(xù)用3d。觀察并記錄雞只的健康狀況和存活情況。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn) 制備的卵黃抗體接種3種培養(yǎng)基均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)；接種的10只雛雞健康狀況良好，未見(jiàn)任何不良反應(yīng)。

2.2 卵黃抗體效價(jià)測(cè)定 經(jīng)AGP法檢測(cè)抗IBDV抗體效價(jià)為1∶256，HA－HI法檢測(cè)抗IBV抗體效價(jià)為1∶1024，滿足生產(chǎn)中對(duì)抗體效價(jià)的要求。

2.3 臨床應(yīng)用觀察 對(duì)于發(fā)病雞，應(yīng)用卵黃抗體的效果要明顯高于常規(guī)病毒唑加抗生素的治療效果，具體結(jié)果見(jiàn)表1。沒(méi)有出現(xiàn)癥狀的雞注射卵黃抗體后，沒(méi)有1只出現(xiàn)感染癥狀，均十分健康，預(yù)防有效率達(dá)100%。

表1 卵黃抗體治療效果的測(cè)定

3 討論

卵黃抗體產(chǎn)量高，不受地域和時(shí)間的限制；生產(chǎn)成本較低，收集和提純方便，大規(guī)模提取抗體的技術(shù)已經(jīng)成熟；因此被廣泛用于動(dòng)物傳染病的緊急治療和預(yù)防中［1－2］。不論雞IBD的卵黃抗體還是IB的卵黃抗體的制備和應(yīng)用都常有報(bào)道，而將兩者結(jié)合制備二聯(lián)抗體卻鮮有報(bào)道。本研究制備了抗IBDVIBV二聯(lián)卵黃抗體，主要是針對(duì)當(dāng)?shù)匾恍B(yǎng)殖場(chǎng)多次發(fā)生了IBDV和IBV混合感染的疫情而定的。從當(dāng)?shù)胤蛛x的病毒株制成滅活疫苗用于加強(qiáng)免疫，這樣獲得的高免卵黃抗體針對(duì)性更強(qiáng)，因此在當(dāng)?shù)匾咔榈念A(yù)防和治療上取得了良好的效果。但是如果在其他地區(qū)應(yīng)用，其預(yù)防和治療的有效性還有待驗(yàn)證。

在臨床試驗(yàn)中，注意到卵黃抗體治療組中死亡的7只雞主要是處在發(fā)病的晚期或者有繼發(fā)感染，而處于發(fā)病早期的病雞全部恢復(fù)。這也驗(yàn)證了一些學(xué)者的研究［3］，即證明卵黃抗體在發(fā)病的早期應(yīng)用通常會(huì)收到良好效果，給疾病的中晚期應(yīng)用效果則不明顯。因此，在實(shí)踐中，一定要注意卵黃抗體應(yīng)用的時(shí)機(jī)，越早注射越能快速控制疫情發(fā)展。

［1］ 李文學(xué)，青學(xué)剛，劉剛.高免卵黃抗體應(yīng)用研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（24）：12981－12982.

［2］ 崔桂清，李火舉.卵黃抗體在防治仔豬腹瀉上的應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（3）：61－63.

［3］ 張鐵，王春光.抗雞新城疫和傳染性法氏囊病高免卵黃抗體的正確應(yīng)用［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2002，29（2）：46.