魏文棟，張 亮*，張 偉

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室，重慶 402460；2.重慶隆生農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，重慶 401120）

2009年至今，中央每年安排至少6.25億元項目資金，對26個?。▍^(qū)、市）及大連、青島、黑龍江農(nóng)墾和廣東農(nóng)墾的400個生豬人工授精普及率30%以上、技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)比較健全、能繁母豬存欄2萬頭以上的縣（區(qū)、農(nóng)場），補貼1650萬頭能繁母豬，支持開展豬人工授精工作。各地紛紛建立豬人工授精站，使得優(yōu)秀公豬的基因能夠被迅速地推廣，同時也使得豬人工授精技術(shù)的發(fā)展取得了長足的進(jìn)步。但是由于許多豬場對豬精子密度的測定多采取目測估計的方法，生產(chǎn)出來的精液產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，嚴(yán)重地影響了母豬的繁殖效率[1]。

所以我們就目前使用較多的進(jìn)口的精液密度儀minitube SDM1[2]（圖1）、國產(chǎn)的721分光光度計（圖2）以及血細(xì)胞計數(shù)板（圖3）手工計數(shù)法測定精液密度的結(jié)果進(jìn)行比較，希望對廣大從事豬鮮精生產(chǎn)的工作者的實際工作能有所幫助。

1 材料與方法

試驗于2012年7月12～30日在重慶市畜牧科學(xué)院養(yǎng)豬研究所育種豬場進(jìn)行，試驗期間公豬舍溫度為25 ℃左右。試驗中分別用3種方法對8頭公豬的18份精液樣品進(jìn)行密度測定。

圖1 minitube SDM1

圖2 分光光度計

1.1 精液采集

采用手握法進(jìn)行采精，使用保溫杯收集精液。采集精液時用3～4層過濾紙濾除精液中的膠質(zhì)等雜質(zhì)，過濾的精液保存在集精杯中。

1.2 精液密度測定

采精后用minitube SDM1、分光光度計[3]以及手工計數(shù)法3種方法測定公豬精液密度，每種方法測定3次，并記錄其密度值。

圖3 血細(xì)胞計數(shù)板

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)在excell 2010中進(jìn)行準(zhǔn)確性和精確性比較，然后在SPSS 17.0中進(jìn)行配對樣本T檢驗，比較不同儀器測定結(jié)果與方法的相關(guān)性和差異。

2 結(jié)果與分析

從圖4可見Minitube SDM1和分光光度計測定精液的結(jié)果與手工計數(shù)法測定結(jié)果相比都偏大，且分光光度計的測定結(jié)果較大。

2.1 不同測定儀器的準(zhǔn)確性和精確性比較

圖4 3種方法測定的精液密度分析

表1 不同檢測方法檢測結(jié)果相關(guān)性

表2 配對T檢驗結(jié)果

對不同儀器3次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差求平均值即對2種儀器的精確性作出判斷。Minitube SDM1與分光光度計測定精子密度的標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.115和0.266，所以用Minitube SDM1測定精子密度的精確性高于分光光度計。

在精液密度檢測的方法中手工計數(shù)法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，所以我們在本次試驗中將手工計數(shù)法得到的結(jié)果看作真實值。將這2種儀器的測定結(jié)果與真實值之差求絕對值后，再求平均值，即可估計出該方法與真實值的接近程度。Minitube SDM1 與 分光光度計 的|x-μ|均值分別為0.73（億/mL）和1.32（億/mL），所以用Minitube SDM1測定精子密度的準(zhǔn)確性高于分光光度計。

2.2 配對樣本的相關(guān)性

從表1表明2種檢測方法與手工計數(shù)的檢測結(jié)果都有極顯著的相關(guān)性（P<0.01），而其中分光光度法與手工計數(shù)法測出的結(jié)果有更高的相關(guān)性。

2.3 配對T檢驗結(jié)果

如表2所示，用Minitube SDM1和分光光度計的測定結(jié)果分別與手工計數(shù)法的測定結(jié)果進(jìn)行配對T檢驗，其T值分別為2.51和5.562，且mintibe SDM1的P值均小于0.05卻大于0.01，而分光光度計的P值小于0.01。故mintibe SDM1測定結(jié)果與手工計數(shù)法的測定結(jié)果存在顯著差異，而和分光光度計測定結(jié)果與手工計數(shù)法的測定結(jié)果存在極顯著差異。

3 結(jié)論與討論

本實驗所用的2種儀器測定精子密度的原理都是利用精液光度值與空白液體光度值的比值來估計樣品中的精子密度[4]，故精液中雜質(zhì)的存在同樣會使精液對光的通透性降低從而使得精子密度被過高地估計，這與我們得到的這2種儀器測定豬精子密度偏高的試驗結(jié)果相符。另外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品中精子密度超過800萬/mL或小于100萬/mL時，Minitube SDM1會報36和35錯誤，也就是說Minitube SDM1測定的范圍為100萬～800萬/mL，所以在精液太濃或太稀的情況下不適合使用Minitube SDM1來測定精子密度。

雖然Minitube SDM1和分光光度計測定精子密度的原理相同，但前者的精確性和準(zhǔn)確性都高于分光光度計的測定結(jié)果。這可能由于分光光度計測量精子密度是根據(jù)光度值和精子密度的對應(yīng)關(guān)系來估計精子密度，精子樣本容量以及精液取樣的誤差都對測定結(jié)果產(chǎn)生直接的影響。配對T檢驗的結(jié)果表明這兩種儀器與手工計數(shù)法的測定結(jié)果均存在顯著差異，那么這2種儀器的測定結(jié)果最好作為精子密度測定的參考值。

而在豬人工授精的實踐中，在大型的人工授精站中每天有大量精液樣品需要測定的情況下，可以發(fā)揮Mnitube SDM1操作簡單、測定迅速的優(yōu)點，在稀釋過程中適當(dāng)減少稀釋倍數(shù)，使得精子數(shù)量達(dá)到輸精要求。然而Mnitube SDM1的耗材價格較高且不可重復(fù)使用，這是制約該儀器無法廣泛應(yīng)用的主要因素。而對于規(guī)模較小的人工授精站或場內(nèi)人工授精站，在檢測樣品數(shù)量較少的情況下，可以使用手工計數(shù)法，能夠得到更準(zhǔn)確的測定結(jié)果。

[1] 王佳輝，高圣明，唐玲玲，等.應(yīng)用種公豬精子密度圖片估算精子數(shù)方法的研究[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2010(5):211-212.

[2] Mario Baracaldo， Jim Ward，溫鵬，等.稀釋公豬精液的品質(zhì)控制[J].今日養(yǎng)豬業(yè)， 2009(3):31-34.

[3] 張亮，郭宗義，潘紅梅，等.分光光度法快速測算公豬精子密度的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，5（39）：103-105.

[4] 張濤，張龍珍，莊平，等.分光光度法測定俄羅斯鱘精子密度標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].海洋漁業(yè)，2009，31(1):87-91.