信璨，常麗新，賈長虹

(河北聯(lián)合大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，河北唐山063009)

月季，別名四季花、月季紅，屬薔薇科植物。月季花的主要活性成分為黃酮和酚酸類化合物，另外還有芳香油、鞣質(zhì)、色素等［1］。月季花氣味清香，味淡，微苦，有活血調(diào)經(jīng)的功能［2］。月季花色素屬花青苷類色素［3］，是一種有效的自由基清除劑，對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基有一定的清除效果［4］。雙水相萃取法快速、操作簡便、可回收利用、投資少、能夠保持物質(zhì)的生物活性［5］，被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、生物化工、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域［6］。本文采用聚乙二醇/硫酸納雙水相體系［7］分離純化月季花色素，為雙水相萃取法分離純化植物色素提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅色月季花瓣于2010年8月采自河北聯(lián)合大學(xué)校園內(nèi)。將采集的新鮮紅色月季花瓣用自來水快速?zèng)_洗干凈，再用去離子水漂洗，于40～50℃下烘干，粉粹，過60目篩后待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

聚乙二醇(PEG 400，600，1000，2000)購于拜爾迪生物技術(shù)有限公司，分析純;無水乙醇、無水硫酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉等購于北京化工廠，分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

JA2003電子天平，上海上平儀器公司;JJ－1A精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;DK－S26型電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠;PHS－3C酸度計(jì)，上海理達(dá)儀器廠;KQ－400KDB高功率數(shù)控超聲波清洗器，常州諾基儀器有限公司;800－離心機(jī)，江蘇金壇城西小陽電子儀器廠;752型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;DHG－9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海－恒科學(xué)儀器有限公司;RE－2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，成都雅榮生化設(shè)備有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 月季花色素粗提液的制備

準(zhǔn)確稱取5.0000g月季花粉末，按1:20的料液比加入95%乙醇［8］浸泡1h;用49KHZ的超聲波［9］提取25min后靜置1h;再用49KHZ超聲波提取25min;3000r/min離心15min后濾紙過濾，用一定量石油醚萃取;真空旋蒸后放置在50℃烘箱12h，得到的液體充分溶解在95%的乙醇溶液中，并定容在100mL的容量瓶中，待用。

2.2 月季花色素精制品的制備

準(zhǔn)確稱取20.0000g月季花粉末，按1:20的料液比加入95%乙醇浸泡1h;用49KHZ的超聲波提取25min后靜置1h;再用49KHZ超聲波提取25min;3000r/min離心15min后過濾，用一定量石油醚萃取;提取液50℃下真空旋蒸;旋蒸后液體過AB－8大孔樹脂，并用60%的乙醇洗脫;洗脫出的液體真空旋蒸后放入50℃烘箱過夜。得到月季花色素精制品。

2.3 最大吸收波長的測定

取月季花色素精制品0.0500g用95%的乙醇溶解，定容在10mL容量瓶中。并加入2滴0.1%的HCL，顏色呈紅色，測定其在400～650nm之間的吸光度［10］，月季花色素吸光度如圖1所示。

圖1 月季花色度吸收光譜圖

由圖1可見，月季花色素在530nm處有最大吸收峰，吸光度為1.721A。

2.4 雙水相體系的配制

小燒杯中加入一定量的PEG，一定量的無水硫酸鈉，一定量的去離子水，一定體積的月季花色素粗提液，使雙水相總質(zhì)量為10g，用磁力攪拌器攪拌至兩相充分混勻，2000 r/min離心5 min，以加速相分離過程。用膠頭滴管吸取上、下相溶液，分別測定上、下相體積，并分別測定530nm下的吸光度［11］。

相比為R=Vu/Vd;分配系數(shù)為K=Cu/Cd;萃取率為Y=1/(1+1/RK)。式中，Vu—上相體積(mL);Vd—下相體積(mL);Cu—上相月季花色素的質(zhì)量濃度(mg/mL);Cd—下相月季花色素的質(zhì)量濃度(mg/mL)。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取0.6500g月季花色素精制品溶解在25ml的95%乙醇中，則濃度為0.0260g/mL。用移液槍分別取0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL 溶液，并用 95%乙醇定容到 10mL 容量瓶中，分別測其在530mn處的吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 月季花色素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=19.782x+0.4411，相關(guān)系數(shù)R2為0.9982，這說明月季花色素濃度為0～16mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與月季花色素濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.2 聚乙二醇(PEG)的選擇

選擇25%分子量分別為400、600、1000和2000的PEG、18%Na2SO4和1mL月季花色素粗提液組成雙水相體系，在30℃下，用磁力攪拌器攪拌至兩相充分混勻，2000r/min離心5min，對(duì)其上、下相溶液進(jìn)行分析，不同分子量PEG下月季花色素的分配系數(shù)和萃取率如圖3所示。

圖3 PEG平均分子量對(duì)雙水相體系的影響

由圖3中可以看出，不同分子量的PEG和18%Na2SO4組成的雙水相系統(tǒng)，均具有良好的分相能力，PEG的分子量越大，分配系數(shù)K和萃取率Y反而降低。這是由于隨著PEG分子量降低，系統(tǒng)粘度減小，水溶性增強(qiáng)。PEG分子量為400時(shí)，分配系數(shù)K和萃取率Y最大，說明月季花色素有很強(qiáng)的親水性。因此雙水相體系選擇PEG 400。

3.4 溫度對(duì)雙水相萃取月季花色素的影響

選擇25%PEG400、18%Na2SO4和1mL月季花色素粗提液組成雙水相體系，在不同溫度下(30℃、40℃、50℃、60℃)，用磁力攪拌器攪拌至兩相充分混勻，2000r/min離心5min，并對(duì)其上、下相溶液進(jìn)行分析，不同溫度下月季花色素的分配系數(shù)和萃取率如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)雙水相體系的影響

由圖4中可以看出，30℃時(shí)月季花色素的萃取率最高，隨溫度的升高，分配系數(shù)K和萃取率Y隨之降低。升溫后會(huì)加快高聚物在水中的溶解，相分離的速度也加快，有利于雙水相的形成，但相比R隨著溫度的升高反而降低，從而影響分配系數(shù)K，導(dǎo)致月季花色素萃取率Y逐漸降低。因此萃取溫度選擇30℃。

3.4 粗提液的體積對(duì)雙水相萃取月季花色素的影響

選擇25%PEG400、18%Na2SO4組成雙水相體系，在30℃下，加入不同體積粗提液(2 mL、1 mL、1/2mL和1/3mL)，用磁力攪拌器攪拌至兩相充分混勻，2000r/min離心5min，并對(duì)其上、下相溶液進(jìn)行分析，不同粗提液體積下月季花色素的分配系數(shù)和萃取率如圖5所示。

由圖5中可以看出，隨粗提液體積的增加，分配系數(shù)K和萃取率Y呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，粗提液體積為1/2mL時(shí)，月季花色素的萃取率Y最高。在工業(yè)化操作中，粗提液體積雖然影響月季花色素提取率，但從經(jīng)濟(jì)上考慮還是加入體積越大越好，粗提液體積為1/2mL與體積為1mL比較，萃取率Y僅相差1.32%，分配系數(shù)K僅相差0.350，因此確定粗提液體積選定為1mL。

圖5 粗提液體積對(duì)雙水相體系的影響

3.5 pH值對(duì)雙水相萃取月季花色素的影響

選擇25%PEG400、18%Na2SO4和1mL月季花色素粗提液組成雙水相體系，在30℃下，濃度為1mol/L的 HCL 調(diào) pH 值至2.0、3.0、4.0和 5.0，用磁力攪拌器攪拌至兩相充分混勻，2000r/min 離心 5min，并對(duì)其上、下相溶液進(jìn)行分析，不同pH值下月季花色素的分配系數(shù)和萃取率如圖6所示。

圖6 pH值對(duì)雙水相體系的影響

由圖6中可以看出，隨溶液pH值的增加，月季花色素的分配系數(shù)K和萃取率Y呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，pH值為2時(shí)月季花色素萃取率最高。

4 結(jié)論

采用實(shí)驗(yàn)方法確定了萃取分離月季花色素的雙水相體系組成為25%PEG 400與18%Na2SO4;雙水相體系中粗提液體積、pH值和溫度等因素對(duì)雙水相體系的相比、分配系數(shù)及萃取率均有一定影響，最佳萃取條件為:溫度30℃;粗提液體積1mL;pH為2.0。在此條件下，月季花色素的萃取率可達(dá)到98.45%。因此采用

PEG/Na2SO4雙水相體系萃取分離月季花色素是可行的。該法具有萃取率高、分相快、溫度低、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，是色素類化合物萃取分離的一種有效方法。

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