黃 凱 崔廣暉 趙 松 李瑋浩 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

肺癌是最常見的原發(fā)惡性腫瘤，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病。許多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡失衡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。Bcl－2結(jié)合抗凋亡基因－1(BAG－1)是20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)的一種抗凋亡基因，其編碼的蛋白是一種多功能結(jié)合蛋白，具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗凋亡的能力。BAG－1基因在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制并未完全明確。本研究采用免疫組化方法研究非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織細(xì)胞中BAG－1基因和Caspase－3基因的表達(dá)及其相互關(guān)系，探討B(tài)AG－1基因和Caspase－3基因在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 我科手術(shù)切除的NSCLC組織標(biāo)本75例，其中男54例，女21例，年齡31～76歲，平均52.3歲。所有病人術(shù)前均未接受過化療和放療。經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為肺癌，其中鱗癌43例，腺癌32例;低分化31例，中分化和高分化癌44例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2009年修訂的肺癌分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期+Ⅱ期40例，Ⅲ期+Ⅳ期35例;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人 BAG－1多克隆抗體、鼠抗人Caspase－3單克隆抗體抗體均購于上海威奧生物科技有限公司，多聚賴氨酸玻片處理劑購于武漢博士得生物工程公司。

1.3 方法 石蠟標(biāo)本制成3 μm厚的切片。常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，微波抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷15 min，分別滴加BAG－1多克隆抗體(1∶125)和 Caspase－3單克隆抗體(1∶100)，置27℃孵育60 min，Ⅱ抗37℃孵育 30 min，Ⅲ抗 37℃孵育30 min，DAB顯色4～8 min，蘇木精復(fù)染后，脫水、透明、封固后光鏡下觀察。用已知的陽性切片染色作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組化陽性細(xì)胞的觀察和圖像分析 采用半定量方法測定 BAG－1、Caspase－3 基因表達(dá)〔1〕。選取5 個(gè)高倍鏡視野(200倍)計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中BAG－1、Caspase－3表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)，分為以下4個(gè)等級(jí):0級(jí)≤5%，5% ＜1級(jí)≤25%，26% ＜2級(jí) ＜60%，3級(jí) ＞60%。根據(jù) BAG－1、Caspase－3免疫組化染色的強(qiáng)度分成以下3個(gè)等級(jí):弱陽性(顯色淡黃或僅個(gè)別細(xì)胞呈黃至棕黃色染色)=1;中等陽性(顯色強(qiáng)度介于弱陽性與強(qiáng)陽性之間)=2;強(qiáng)陽性(多數(shù)細(xì)胞呈棕黃至棕褐色染色)=3;以陽性細(xì)胞數(shù)分值與染色強(qiáng)度分值的乘積為每例患者的積分，積分0～1分為表達(dá)陰性(－)，2～3分為表達(dá)弱陽性(+)，4～6分為表達(dá)中度陽性，＞6分為表達(dá)強(qiáng)陽性。弱陽性歸為陰性表達(dá)。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BAG－1基因在NSCLC組織細(xì)胞中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化結(jié)果表明，BAG－1陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于胞漿中，在胞核中也有少量存在。74例NSCLC中，BAG－1基因的表達(dá)率為64.0%(48/75)，其表達(dá)與NSCLC細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P＜0.05)。見表1。

表1 BAG-1基因及Caspase-3基因陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 Caspase－3基因在NSCLC組織細(xì)胞中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化檢測結(jié)果表明，Caspase－3陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于胞漿中。74例NSCLC組織細(xì)胞中Caspase－3基因的表達(dá)率為57.3%(43/75)，其表達(dá)與NSCLC病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系(χ2=5.96，P＜0.05)。見表1。

2.3 BAG－1與 Caspase－3基因在 NSCLC中表達(dá)的關(guān)系 在NSCLC組織細(xì)胞中，BAG－1基因表達(dá)與Caspase－3基因表達(dá)呈高度正相關(guān)(r=0.436，P ＜0.01)。

3 討論

BAG－1是共輔助分子家族成員，最早是作為Bcl－2結(jié)合蛋白而被發(fā)現(xiàn)的，其不僅有獨(dú)立地抗凋亡作用而且可以增強(qiáng)Bcl－2的抗凋亡活性，同時(shí)可以和HSC/HSP70、RA F21、核激素受體等多種靶分子相互作用而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移和移動(dòng)性〔1〕，從而使BAG－1通過多種途徑在腫瘤的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，同時(shí)可間接反映腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)。BAG－1在大部分正常人體組織中呈微弱表達(dá)或不表達(dá)，但在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系均有表達(dá)，提示 BAG－1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)〔2～4〕。本研究結(jié)果顯示，BAG－1表達(dá)與腫瘤 TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與組織細(xì)胞類型、年齡、性別無明顯相關(guān)。說明BAG－1的存在預(yù)示腫瘤有較高的侵襲性與不良預(yù)后，其機(jī)制可能是由于BAG－1與抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

Caspase－3主要是降解多 ADP－核糖多聚合成酶(Poly－PARP)及UI小核核糖核蛋白。PARP的降解可導(dǎo)致核內(nèi)核酸酶的激活，使核小體間DNA鏈水解斷裂，產(chǎn)生凋亡所特有的DNA節(jié)段化。目前已公認(rèn):在多種刺激引起的凋亡中Caspase－3是關(guān)鍵的效應(yīng)分子〔5〕。本研究結(jié)果表明，Caspase－3基因在NSCLC中的低表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能起重要的作用。但在本研究中Caspase－3基因的表達(dá)與NSCLC組織類型、分化程度、TNM分期無關(guān)。

本研究顯示，Caspase－3基因的表達(dá)與BAG－1基因表達(dá)具有顯著負(fù)相關(guān)性?？梢哉J(rèn)為，Caspase－3和BAG－1可能共同參與肺細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)，即Caspase－3基因的低表達(dá)有助于NSCLC的發(fā)生，BAG－1作為一種凋亡抑制蛋白在NSCLC中能夠減低 Caspase－3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。Caspase－3基因和BAG－1基因表達(dá)的關(guān)系對(duì)NSCLC發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。

1 Sharp A，Cutress RI，Johnson PW，et al.Short peptides derived from the BAG－1 C－terminus inhibit the interaction between BAG－1 and HSC70 and decrease breast cancer cell growth〔J〕.FEBS Lett，2009;583(21):3405－11.

2 Alper M，Cukur S，Belenli O，et al.Evaluation of the immunohistochemical stain patterns of survivin，Bak and Bag－1 in colorectal cancers and comparison with polyps situated in the colon〔J〕.Hepatogastroenterology，2008;55(85):1269－73.

3 Wood J，Lee SS，Hague A.Bag－1 proteins in oral squamous cell carcinoma〔J〕.Oral Oncol，2009;45(2):94－102.

4 Liu HY，Wang ZM，Bai Y，et al.Different BAG－1 isoforms have distinct functions in modulating chemotherapeutic－induced apoptosis in breast cancer cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2009;30(2):235－41.

5 Hunter AM，LaCasse EC，Korneluk RG.The inhibitors of apoptosis as cancer targets〔J〕.Apoptosis，2007;12(9):1543－68.