李云龍，楊章平，常玲玲，冀德君，王小龍，甘宗輝，劉 姍，劉賢慧

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

牛奶中脂肪酸主要是甘油三酯，此外還含有少量磷脂和甾醇。脂肪酸主要分為三類(lèi)：第一類(lèi)為水溶性揮發(fā)性脂肪酸，如丁酸、乙酸等；第二類(lèi)為非水溶性揮發(fā)性脂肪酸，如十二碳酸等；第三類(lèi)是非水溶性不揮發(fā)性脂肪酸，如十四碳酸等［1］。牛乳脂肪中含有C20～C23的奇數(shù)碳原子脂肪酸，也發(fā)現(xiàn)有帶側(cè)鏈的脂肪酸。乳脂中的不飽和脂肪酸主要是油酸，約占不飽和脂肪酸總量的70%左右。乳脂肪的組成受飼料、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境、季節(jié)等因素的影響［2］。一般夏季乳中不飽和脂肪酸含量升高，而冬季不飽和脂肪酸含量下降。

牛奶中脂肪酸的檢測(cè)方法可以分為好幾種，比較粗略的分析方法有紫外分光光度法和紅外分析，根據(jù)光譜中吸收峰的位置和形狀來(lái)推斷未知物結(jié)構(gòu)，依照特征吸收峰的強(qiáng)度測(cè)定各組分的含量［3，4］。近幾十年來(lái)，銀離子高效液相色譜（Ag＋－HPLC））廣泛用于分離飽和度不相同的脂肪酸有效方法，流動(dòng)相中添加銀離子后，可降低帶有不飽和雙鍵化合物的保留時(shí)間。

Ag＋－HPLC能有效地完成共軛亞油酸甲酯順、反幾何異構(gòu)體的分離［5］。目前，脂肪酸測(cè)定普遍使用氣相色譜法（GC－FID），大多數(shù)科學(xué)研究人員也把GC－FID作為測(cè)定總脂肪酸含量的重要工具。極性毛細(xì)管柱的高溶解性，使得氣相色譜法（GC）能順利完成分析和定量的任務(wù)［6］。此外，氣質(zhì)連用方法（GC－MS）準(zhǔn)確的分析不同脂肪酸所含的碳原子數(shù)，對(duì)同分異構(gòu)體還能確定雙鍵所在的位置，因此，如果采用適宜的衍生化方法，GC－MS是用于鑒定分析共軛亞油酸（CLA）異構(gòu)體的非常有用的工具［7］。本研究建立了極性毛細(xì)管氫離子火焰檢測(cè)方法（GCFID），用來(lái)檢測(cè)牛奶中脂肪酸的組成和含量，為研究牛奶中脂肪酸的變化規(guī)律奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

采集揚(yáng)大農(nóng)牧場(chǎng)150頭中國(guó)荷斯坦奶牛的奶樣，奶樣為早：中：晚＝4∶3∶3的混合奶樣，－20℃冷凍保存，用于脂肪酸組成與含量的分析。

1.2 主要儀器和試劑

氣相色譜儀為Agilent 7890A，c9，t11CLA甲酯和t10，c12CLA甲酯購(gòu)自美國(guó)Matreya公司，37種脂肪酸混標(biāo)和c18∶1trans－11（TVA）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。

1.3 本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的脂肪酸氣相色譜檢測(cè)方法

脂肪酸的前處理參照GB／T21676－2008《乳與乳制品脂肪酸測(cè)定氣相色譜法》［8］，采用 Agilent HP－88專(zhuān)用脂肪酸甲酯毛細(xì)管柱。氣相色譜檢測(cè)條件：進(jìn)樣口溫度250℃，分流比20∶1，檢測(cè)器溫度260℃，載氣為高純度氮?dú)?，流速?mL／min，采用程序升溫步驟，初始溫度140℃，保持5min，以6℃／min升溫到200℃，保持20min，再以2℃／min升溫到220℃，保持20min。

1.4 定性和定量方法

以保留時(shí)間定性，以面積百分比法定量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 氣相色譜檢測(cè)結(jié)果

在上述優(yōu)化的氣相色譜檢測(cè)條件下，先進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品、2種CLA標(biāo)準(zhǔn)品和TVA標(biāo)準(zhǔn)品得到很好的分離，再用同樣的方法檢測(cè)牛奶樣品中脂肪酸的組成（圖2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸的保留時(shí)間可以定性，根據(jù)樣品中脂肪酸的峰面積可以用面積百分比定量。表1所表示的是在牛奶中所檢測(cè)到的各種脂肪酸的比例和變化范圍。

2.2 樣品的加標(biāo)回收率測(cè)定

圖1 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖

圖2 原料乳脂肪酸色譜圖

取0.5mL樣品液（c9t11CLA濃度已知0.322 mg／mL）6份，濃度計(jì)為C1，分別加c9t11CLA標(biāo)準(zhǔn)液（c9t11CLA 0.5mg／mL）0.5mL，濃度記為 C2，作為加標(biāo)樣品液，組分含量為C，按上述GC檢測(cè)條件測(cè)定加標(biāo)樣品液組分C的含量?；厥章剩?）＝C／（C1＋C2）×100%，結(jié)果見(jiàn)表2。平均回收率為99.588%，由此可見(jiàn)該方法檢測(cè)具有很高的準(zhǔn)確度。

2.3 精密度檢測(cè)

平行測(cè)定樣品6次，其測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3?？梢钥闯龃朔椒ň哂泻芎玫闹噩F(xiàn)性。

表1 原料乳中各脂肪酸含量及變化范圍（M±SD）

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

表3 精密度測(cè)定結(jié)果

3 討論

在食物脂肪酸的分析技術(shù)中，樣品預(yù)處理在整個(gè)分析過(guò)程中至關(guān)重要，其中樣品預(yù)處理的一個(gè)主要方法就是使被測(cè)物生成衍生物的方法，而甲酯化方法是目前衍生化方法中最常用、最有效的方法［9］。Christie（1982）［10］的方法一直被認(rèn)為是經(jīng)典的甲酯化方法。卜登攀在乳脂分離和甲酯化方法上做了優(yōu)化研究，共采用4種方法，結(jié)果表明：采用高速離心或者高速離心結(jié)合有機(jī)溶劑分離乳脂肪后采用酸堿甲酷化，不僅對(duì)于乳脂大部分常規(guī)脂肪酸組成沒(méi)有顯著的影響，同時(shí)能彌補(bǔ)乳脂肪提取時(shí)存在耗時(shí)、工作量大、環(huán)境污染、成本高和處理效率低的缺陷。王小靜［2］采用離心加有機(jī)溶劑提取脂肪酸，用堿性方法甲醇－甲醇鈉甲酯化后，進(jìn)行氣相色譜分析，測(cè)得的回收率為100.14%，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.77%。本研究采用國(guó)標(biāo) GB／T21676－2008的方法進(jìn)行甲酯化，先用有機(jī)溶劑提取脂肪酸，再用氫氧化鉀甲醇和三氟化硼進(jìn)行甲酯化，甲酯化在95℃水浴鍋中短時(shí)間進(jìn)行，因?yàn)橛醒芯勘砻骷柞セ瘻囟冗^(guò)低會(huì)造成甲酯化不完全，而長(zhǎng)時(shí)間高溫甲酯化又會(huì)產(chǎn)生異構(gòu)體，影響檢測(cè)結(jié)果［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王小靜的結(jié)果相比較，在檢出的脂肪酸種類(lèi)上多出10種，有可能是所用的標(biāo)準(zhǔn)品脂肪酸種類(lèi)含量較多，可以用于定性的脂肪酸種類(lèi)相應(yīng)增加，與卜登攀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致，只是在個(gè)別脂肪酸cis12C18∶1、C20∶4和C20∶5上有所區(qū)別。在GC分析時(shí)所選用柱子的類(lèi)型和長(zhǎng)度均對(duì)分析結(jié)果有很大的影響。柱子的固定相決定了柱子的性質(zhì)和用途，柱子的長(zhǎng)度決定了對(duì)物質(zhì)分離的好壞，為了得到較好的分離效果，在本實(shí)驗(yàn)中，采用安捷倫Agilent HP－88極性非常強(qiáng)的脂肪酸甲酯測(cè)定專(zhuān)用毛細(xì)管柱是非常必要的［12］。此外，程序升溫法在氣相色譜檢測(cè)中還是必要的，它可以按照組分沸點(diǎn)的不同連續(xù)地隨時(shí)間線性或非線性逐漸升高，使柱溫與組分的沸點(diǎn)相互對(duì)應(yīng)，以使低沸點(diǎn)組分和高沸點(diǎn)組分在色譜柱中都有適宜的保留、色譜峰分布均勻且峰形對(duì)稱(chēng)。

總之，采用毛細(xì)管氣相色譜一氫火焰離子化檢測(cè)器測(cè)定乳脂中脂肪酸組成的方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、耗用試劑少，靈敏度及回收率高，重現(xiàn)性好等諸多特點(diǎn)。該方法不僅可以做定性分析，還可以做定量分析，對(duì)于乳制品來(lái)源的其它脂肪酸含量的測(cè)定也具有指導(dǎo)意義，很適宜推廣應(yīng)用。

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