黃 英

（云南省麗江市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 麗江 674100）

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定，在進(jìn)行藥品微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)對(duì)所用方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查［1］。有些中成藥含有較強(qiáng)的抑菌成分，由于抑菌成分的干擾，采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查，其結(jié)果不能真實(shí)反映其污染的微生物的狀況。為使檢測(cè)結(jié)果科學(xué)、準(zhǔn)確，檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。本文通過(guò)對(duì)乙肝清熱解毒片等中成藥進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明：對(duì)具有抑菌作用的中成藥，其抑菌作用的強(qiáng)弱不同，進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，要消除其抑菌活性所采用的方法也不同。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌種 枯草桿菌［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］均由云南省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂，MUG、麥康凱瓊脂、膽鹽乳糖、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基為北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司和北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司生產(chǎn)。按規(guī)定進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查為合格。稀釋劑為pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液。

1.3 樣品 乙肝清熱解毒片等中成藥共12個(gè)品種見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

按《中國(guó)藥典》2010年版微生物限度檢查法［1］進(jìn)行驗(yàn)證。

2.1 菌液制備

2.1.1 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1mL，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－5～10－7，使成50～100cfu·mL－1，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。

2.1.2 取經(jīng)23～28℃ 培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1mL，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－5～10－6，使成50～100cfu·mL－1，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。

2.1.3 取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，用5mL含0.05%（mL／mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸出孢子懸液1mL至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL／mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。

2.2 供試液制備 稱樣品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，得1∶10供試液。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 細(xì)菌、霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，可按該供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌與酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用稀釋法、薄膜過(guò)濾法等消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。

2.3.1 平皿菌落計(jì)數(shù)法（常規(guī)法） 取供試液（1∶10）1mL入皿，然后每皿加營(yíng)養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，搖勻，按《中國(guó)藥典》2010年版附錄微生物限度檢驗(yàn)方法進(jìn)行。各試驗(yàn)菌回收率結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 取上述供試液（1∶10）1mL，注入5個(gè)平皿中（每平皿0.2mL），然后每皿加營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，搖勻，按《中國(guó)藥典》2010年版附錄微生物限度檢驗(yàn)方法進(jìn)行。各試驗(yàn)菌回收率結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3 薄膜過(guò)濾法 取上述供試液（1∶10）1mL，加入置有100mL沖洗液的濾器中，經(jīng)減壓抽濾干凈后，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗，每次約100mL，共沖洗400mL／膜，在最后1次沖洗液中加入50～100cfu。濾干后取膜，菌面向上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，經(jīng)35℃培養(yǎng)3d后，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。各試驗(yàn)菌回收率結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 乙肝清熱解毒片等中成藥常規(guī)法（1mL／皿）各試驗(yàn)菌回收率（%）

表2 培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）和薄膜過(guò)濾法回收率（%）

2.4 控制菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn) 試驗(yàn)組：取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗(yàn)菌株，加入相應(yīng)規(guī)定量的培養(yǎng)基中，按各控制菌檢查法檢查。樣品組：取規(guī)定量供試液，加入相應(yīng)規(guī)定量的培養(yǎng)基中，按各控制菌檢查法檢查。

3 結(jié)果分析

3.1 結(jié)果表明 乙肝清熱解毒片等中成藥對(duì)5株陽(yáng)性代表菌有不同程度的抑菌活性。如乙肝清熱解毒片對(duì)大場(chǎng)埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉無(wú)抑菌作用，如常規(guī)法（1mL／皿）試驗(yàn)菌回收率大場(chǎng)埃希菌分別為78%、85%、77%。對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，而且乙肝清熱解毒片對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌作用比對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用強(qiáng)。

3.2 表1所見(jiàn)，珍菊降壓片、保兒寧顆粒、傷痛寧片、天麻頭風(fēng)靈膠囊 、養(yǎng)血安神片對(duì)5種陽(yáng)性對(duì)照菌的回收率均高于70%，無(wú)抑菌作用，因此平皿菌落計(jì)數(shù)法（常規(guī)法）可用于此5種中成藥的微生物限度檢查。益脈康膠囊、清肺抑火膠囊、乙肝清熱解毒片、平肝疏絡(luò)丸、清開(kāi)靈滴丸、丹參益心片、同仁牛黃清心丸對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌作用，回收率均低于70% 。

3.3 表1所述中成藥，對(duì)大腸埃希菌、霉菌和酵母菌無(wú)抑菌作用，回收率高于70%，因此平皿菌落計(jì)數(shù)法（常規(guī)法）可用于上述12種中成藥的大腸埃希菌、霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)檢查。

3.4 表2所見(jiàn)：經(jīng)培養(yǎng)基稀釋（每平皿0.2mL），益脈康膠囊、清肺抑火膠囊、乙肝清熱解毒片、平肝疏絡(luò)丸已無(wú)明顯抑菌能力，回收率均高于70%，表明培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）可用于上述4種中成藥的微生物限度檢查。清開(kāi)靈滴丸、丹參益心片、同仁牛黃清心丸常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）檢驗(yàn)時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑菌作用，回收率低于70%，采用薄膜過(guò)濾法，回收率均大于70%，因此，薄膜過(guò)濾法可用于清開(kāi)靈滴丸、丹參益心片、同仁牛黃清心丸的微生物限度檢查。

3.5 控制菌檢查結(jié)果 試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，樣品組未檢出控制菌。各必檢控制菌均可用常規(guī)法檢查。

4 討論

4.1 選擇適當(dāng)?shù)臋z查方法，可提高微生物檢出率。對(duì)無(wú)抑菌作用的中成藥，用常規(guī)法進(jìn)行藥品的微生物限度檢查，對(duì)于抑菌作用較強(qiáng)的中成藥，用培養(yǎng)基稀釋法簡(jiǎn)便有效，對(duì)于抑菌作用很強(qiáng)的中成藥，用稀釋法難以消除供試品的抑菌作用，可選用薄膜過(guò)濾法或是幾種方法聯(lián)用消除其抑菌活性，使檢查結(jié)果更真實(shí)反映藥品的污染情況。

4.2 乙肝清熱解毒片等上述12種中成藥進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，試驗(yàn)菌株僅選用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌2株菌即可，這樣即可保證檢驗(yàn)方法的有效性，又節(jié)省了大量的人力和物力。

［1］中華人民共和國(guó)，中國(guó)藥典［S］.北京：化工出版社，2010.79～88.