王 瑩，李文媛，劉艷翠，丁 利，趙斯達(dá)

(牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江牡丹江157011)

低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIF)是細(xì)胞低氧情況下調(diào)控基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，主要包括HIF-1α和HIF-3α等亞基，是目前腦缺血缺氧性疾病基因治療中的研究熱點(diǎn)。HIF-1α和HIF-3α可通過促進(jìn)血管形成、紅細(xì)胞生成等途徑使神經(jīng)元細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境，對神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用［1］。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSCs)是具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，具有易于在體外大量擴(kuò)增、移植到神經(jīng)系統(tǒng)后仍可增殖、免疫原性小、能夠定向遷移等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的研究。有文獻(xiàn)報道［2］，NSCs移植能夠改善腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)，但具體作用機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)將通過觀察NSCs對大鼠腦缺血損傷海馬區(qū)HIF-1α和HIF-3α表達(dá)的影響，以探討NSCs移植治療腦缺血/再灌注損傷的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物、藥品及試劑 雄性SD大鼠18只，清潔級，體質(zhì)量280～320 g，購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號:SYXK［遼］2003-0013)。兔抗大鼠HIF-1α抗體、兔抗大鼠HIF-3α抗體、免疫組織化學(xué)SP試劑盒購于北京中山生物試劑公司。PKH-26試劑盒購于美國sigma公司。

1.2 NSCs培養(yǎng)及 PKH26標(biāo)記 無菌條件下分離出SD大鼠海馬組織，參照佟雷等［2］的方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，并換液傳代，分離培養(yǎng)取第3～5代的 NSCs，制成單細(xì)胞懸液后，參照王瑩［3］的方法進(jìn)行PKH26標(biāo)記NSCs。

1.3 動物分組與模型制備參照李文媛等［4］的線栓改良法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血模型，將18只大鼠隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組、模型組、NSCs組，各6只。建模成功后3 h分別經(jīng)尾靜脈注射等體積的生理鹽水和已制備好的PKH26標(biāo)記的同種異體 NSCs懸液(0.5 mL，4 ×106個/mL)，再灌注72 h后取腦，在視交叉后1～4 mm處冠狀切面切開，取海馬組織。

1.4 神經(jīng)功能評估 采用李文媛等［4］報道的神經(jīng)功能損害評分表(neurological severity scores，NSS)從運(yùn)動、感覺、反射、平衡四方面進(jìn)行神經(jīng)功能損害評估，22分為最嚴(yán)重的神經(jīng)功能損害，即評分越高神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測 嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行操作，其中一抗?jié)舛菻IF-1α為1∶80、HIF-3α 為1∶80。以磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照。陽性率的定量分析:每個標(biāo)本取4張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬隨機(jī)選5個視野，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(HPIAS-1000)對各組陽性細(xì)胞進(jìn)行光密度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)以采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬NSCs的原代和傳代培養(yǎng) 大鼠海馬分離的NSCs生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)第7天時能看到直徑約為100 μm的克隆球，克隆球狀態(tài)良好，球周圍附著輪廓清晰的圓形的單個細(xì)胞。傳代培養(yǎng)細(xì)胞增殖較原代快，在傳代培養(yǎng)第7天時能形成直徑約200 μm的克隆球。

2.2 NSCs移植對神經(jīng)功能損害的影響 模型組和NSCs組的 NSS 評分分別為(8.43 ±1.45)分和(5.87±1.31)分，前者顯著高于后者，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 PKH-26標(biāo)記觀察 冷凍切片免疫熒光追蹤PKH-26標(biāo)記的移植NSCs，可見NSCs組在海馬區(qū)有紅色熒光信號表達(dá)。而假手術(shù)組和模型組沒有發(fā)現(xiàn)紅色熒光信號。

2.4 NSCs移植對HIF-1α和HIF-3α的影響 HIF-1α和HIF-3α陽性細(xì)胞胞質(zhì)染色呈棕黃色，陰性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)不著色。假手術(shù)組未見HIF-1α和HIF-3α蛋白表達(dá)，模型組HIF-1α和HIF-3α蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著增加。與模型組比較，NSCs組HIF-1α和HIF-3α蛋白相對表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(表1)。

表1 海馬區(qū)HIF-1α和HIF-3α蛋白表達(dá)

3 討論

HIF是目前治療腦缺血性疾病的研究熱點(diǎn)，可以對缺血缺氧神經(jīng)元細(xì)胞起保護(hù)作用，其中HIF-1α和HIF-3α具有誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、上調(diào)葡萄糖載體、抗氧化酶、熱蛋白和抗凋亡基因表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞生存等生物學(xué)功能［1］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血72 h后模型組HIF-1α和HIF-3α表達(dá)較假手術(shù)組顯著增高，提示HIF-1α和HIF-3α在腦缺血/再灌注早期發(fā)揮重要作用，這一結(jié)果與以前的研究結(jié)果相一致［5］。

NSCs具有多分化的潛能，能自我更新分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，被認(rèn)為是改善腦缺血/再灌注損傷的良好種子細(xì)胞［2］。本研究發(fā)現(xiàn)PKH26標(biāo)記移植的NSCs在海馬區(qū)大量存在，而且NSCs移植后大鼠神經(jīng)功能損傷評分低于模型組，證實(shí)尾靜脈注射的NSCs能夠通過血-腦脊液屏障大量遷移至海馬區(qū)發(fā)揮神經(jīng)再生作用，促進(jìn)腦神經(jīng)功能恢復(fù)。有研究表明HIF家族基因在干細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，能促進(jìn)干細(xì)胞增殖和分化［6］，而關(guān)于干細(xì)胞對HIF家族成員表達(dá)的影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCs組移植后海馬區(qū)HIF-1α和HIF-3α的蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組，提示NSCs移植能夠通過上調(diào)海馬區(qū)HIF-1α和HIF-3α的表達(dá)水平，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，NSCs移植具有促進(jìn)腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的能力，其機(jī)制可能與其上調(diào)海馬區(qū)HIF-1α和HIF-3α的表達(dá)水平有關(guān)。

［1］Yuan LB，Dong HL，Zhang HP，et al.Neuroprotective effect of orexin-A is mediated by an increase of hypoxia-inducible factor-1 activity in rat［J］.Anesthesiology，2011，114(2):340-354.

［2］佟雷，季麗莉，解大龍，等.堿性成纖維生長因子和神經(jīng)生長因子聯(lián)合應(yīng)用培養(yǎng)成年大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(1):74-77.

［3］王瑩，李文媛，李明秋，等.黃芪皂甙Ⅳ聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞對老齡大鼠腦缺血再灌注中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響［J］.中國老年學(xué)志，2011，31(20):3963-3966.

［4］李文媛，王瑩，李明秋，等.黃芪皂苷Ⅳ對大鼠腦缺血/再灌注后海馬血管生成的影響［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，6(17):1727-1729.

［5］Lushnikova I，Orlovsky M，Dosenko V，et al.Brief anoxia preconditioning and HIF prolyl-hydroxylase inhibition enhances neuronal resistance in organotypic hippocampal slices on model of ischemic damage［J］.Brain Res，2011，1386:175-183.

［6］Zhu LL，Wu LY，Yew DT，et al.Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs［J］.Mol Neurobiol，2005，31(1/3):231-242.