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        漢防己甲素對人鼻咽癌細胞株的放射增敏作用及其機制*

        2012-08-02 06:26:42吳喜福張革化黎景佳黃健聰嚴睿成謝逢安
        中國病理生理雜志 2012年12期
        關(guān)鍵詞:劑量實驗

        吳喜福, 張革化△, 黎景佳, 黃健聰, 王 凱,嚴睿成, 鄭 堅, 謝逢安, 葉 進, 劉 賢

        (1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,廣東 廣州 510630;暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院2腫瘤科,3直線加速器室,廣東 廣州 510632)

        鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma,NPC)是源于鼻咽部上皮的鱗狀細胞癌,因解剖位置隱匿、毗鄰重要器官,治療以放射治療為首選。雖然放療技術(shù)的發(fā)展明顯提高了早期NPC患者的5年總生存率,但晚期患者療效仍不理想。治療失敗的主要原因之一是放療后腫瘤局部殘留或復(fù)發(fā)。NPC細胞對放射線抵抗是一個突出的問題,已有研究顯示放射抵抗者高達23.2%[1-2]。同步放化療雖提高了 NPC的療效,但伴隨的毒副反應(yīng)使患者的依從性下降,5年總生存率仍未獲得明顯改善[3]。因此,如何提高NPC對放射線照射的敏感性成為亟待解決的問題。

        研究發(fā)現(xiàn)漢防己甲素(tetrandrine,Tet)具有抗腫瘤效應(yīng),并能增加腫瘤細胞對放射線照射的敏感性[4]。本研究擬探討 Tet對人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2是否具有放射增敏作用,并研究其增敏機制,為尋找NPC的放射增敏劑提供理論依據(jù)。

        材料和方法

        1 細胞

        人NPC高分化鱗癌細胞株CNE1和低分化鱗癌細胞株CNE2由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院惠贈。細胞采用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),每2~3 d傳代1次。

        2 主要試劑

        Tet購于大連富生天然藥物開發(fā)有限公司(純度>98%),溶液配制方法參考文獻[5]。四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT]購于 Sigma,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購于天津市大茂化學(xué)試劑廠,細胞周期試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

        3 細胞照射

        采用SIEMENZ直線加速器產(chǎn)生的6 MV的X線照射細胞,劑量率為2.5 Gy/min。照射時在細胞培養(yǎng)板加墊0.5 cm厚的有機玻璃板及硅膠補償膜,放射源至細胞的距離為100 cm,照射野為25 cm×25 cm。

        4 主要方法

        4.1 細胞增殖抑制實驗

        4.1.1 Tet增殖抑制實驗 CNE1和 CNE2細胞分別以每孔1000個接種于96孔板,每組5個平行孔,待細胞貼壁后分別給予 0、1、2、3、4、5、10 和 20 μmol/L Tet溶液培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng),每孔加入5 g/L的MTT 20 μL,繼續(xù)孵育4 h后,吸去孔內(nèi)上清液并加入DMSO 150 μL,振蕩10 min后于490 nm波長測定吸光度值,計算Tet的半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC50)。

        4.1.2 Tet最大非細胞毒性劑量篩選實驗 CNE1和CNE2細胞分別以每孔1000個接種于96孔板,每組5個平行孔,待細胞貼壁后分別給予0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8 和 2 μmol/L Tet溶液培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后細胞換液。MTT法測定吸光度值,連續(xù)檢測6 d,繪制不同Tet劑量下的細胞生長曲線。

        4.1.3 Tet聯(lián)合放射線照射對細胞增殖抑制實驗設(shè)立空白對照組和單純Tet組、單純放射線照射組和Tet聯(lián)合放射線照射組。CNE1和CNE2細胞分別以每孔1000個接種于96孔板,每組5個平行孔,待細胞貼壁后單純放射線照射組及Tet聯(lián)合放射線照射組給予4 Gy放射線照射,照射結(jié)束后,單純Tet組及Tet聯(lián)合放射線照射組立即給予最大非細胞毒性劑量的Tet溶液培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后細胞換液。MTT法測定吸光度值,連續(xù)檢測6 d,繪制各組的細胞生長曲線。

        4.2 克隆形成實驗 操作方法參考文獻[6],設(shè)立單純放射線照射組和Tet聯(lián)合放射線照射組。CNE1和 CNE2 細胞分別以 100、200、400、800、2000 和5000個接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿,每組3個平行皿,待細胞貼壁后分別給予 0、1、2、4、6 和 8 Gy放射線照射,照射結(jié)束后,Tet聯(lián)合放射線照射組立即給予最大非細胞毒性劑量的Tet溶液培養(yǎng)24 h。細胞換液后繼續(xù)培養(yǎng),待10~12 d長出肉眼可見的克隆后,吸去培養(yǎng)基,PBS洗滌、甲醇固定、姬姆薩染色,計算50個細胞以上的克隆數(shù)。根據(jù)克隆數(shù)計算克隆形成率、細胞存活分數(shù),采用單擊多靶模型擬合細胞存活分數(shù)曲線及放射生物學(xué)參數(shù)平均致死劑量(mean lethal dose,Do)、準閾劑量(quasi-field dose,Dq)、2 Gy 細胞存活分數(shù)(survival fraction at 2 Gy,SF2)及放射增敏比(senitivity enhancement ratio,SER)。克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。細胞存活分數(shù)(%)=某一劑量照射組的克隆數(shù)/(該組接種細胞數(shù)×PE)×100%。SER=單純放射線照射組Do/Tet聯(lián)合放射線照射組Do[7]。

        4.3 流式細胞儀檢測細胞周期 設(shè)立空白對照組、單純Tet組、單純放射線照射組和Tet聯(lián)合放射線照射組。CNE1和CNE2細胞分別以2×105cells/well接種于6孔板,每組3個平行孔,待細胞貼壁后單純放射線照射組及Tet聯(lián)合放射線照射組給予4 Gy放射線照射,照射結(jié)束后,單純Tet組及Tet聯(lián)合放射線照射組立即給予最大非細胞毒性劑量的Tet溶液培養(yǎng)24 h。胰酶消化、收集細胞,PBS洗滌、70%乙醇固定過夜。RNase A 37℃水浴30 min,PI避光染色30 min,流式細胞術(shù)檢測細胞周期。

        5 統(tǒng)計學(xué)處理

        結(jié) 果

        1 細胞增殖抑制實驗

        Tet對細胞具有增殖抑制作用,濃度越高增殖抑制作用越明顯,提示其增殖抑制作用具有濃度依賴性;Tet對CNE1和CNE2細胞的IC50分別為(12.44±0.05)μmol/L 和(13.39 ± 0.09)μmol/L,見圖1A。當(dāng) Tet分別為 1.5 μmol/L 和 1.8 μmol/L 時,CNE1和CNE2細胞的生長曲線與空白對照組生長曲線相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示該劑量的Tet為最大非細胞毒性劑量,見圖1B、C。

        單純放射線照射組與空白對照組相比,細胞增殖受到抑制,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而Tet聯(lián)合放射線照射組與單純放射線照射組相比,最大非細胞毒性劑量的Tet干預(yù)使CNE1和CNE2細胞增殖明顯受到抑制,第4~6 d時明顯,2組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.01),見圖1D、E。

        Figure1.Inhibitory effect of Tet on the proliferation of CNE1 and CNE2 cells.A:relative survival after exposure to Tet for 24 h;B and C:the maximum non-cytotoxic dose of Tet;D and E:the inhibitory effect of Tet and radiation on the proliferation..n=3.*P <0.05 vs control;▲▲P <0.01 vs 4 Gy.圖1 細胞增殖抑制實驗

        2 克隆形成實驗

        采用單擊多靶模型擬合細胞存活分數(shù)曲線并計算放射生物學(xué)參數(shù),結(jié)果提示CNE1和CNE2細胞的SF2分別為 0.42 ±0.05 和 0.54 ±0.02,見圖 2。CNE1細胞:單純放射線照射組的Do和Dq分別為1.26 ±0.02 Gy和0.93 ±0.12 Gy,Tet聯(lián)合放射線照射組Do和Dq分別為(0.73±0.05)Gy和(0.67±0.03)Gy;CNE2細胞:單純放射線照射組的Do和Dq分別為(2.27 ±0.04)Gy 和(1.24 ±0.08)Gy,Tet聯(lián)合放射線照射組 Do和 Dq分別為(1.61±0.08)Gy和(1.10 ±0.06)Gy。Tet對 CNE1 和CNE2細胞的 SER分別為1.73和1.40(P <0.05)。

        3 流式細胞儀檢測細胞周期

        空白對照組CNE1和CNE2細胞的G1期細胞比例分別為(65.23 ±9.33)%和(44.47 ±2.55)%,單純Tet組G1期細胞比例分別為(67.39±4.65)%和(51.90 ±8.90)%,G1期細胞比例雖有所升高,但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)??瞻讓φ战MCNE1和CNE2細胞的 G2期細胞比例分別為(11.41±1.50)%和(14.48±1.80)%,而單純放射線照射組G2期細胞比例分別為(42.62 ±2.07)%和(34.82 ±2.74)%,2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Tet聯(lián)合放射線照射組,2株細胞G2期細胞比例分別為(17.02 ±1.87)%和(19.64 ±4.82)%,與單純放射線照射組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖3。

        Figure2.Colony formation assay.-Tet:radiation group;+Tet:Tet plus radiation group..n=3.*P<0.05 vs-Tet.圖2 克隆形成實驗

        Figure3.Cell cycle analyzed by flow cytometry..n=3.**P<0.01 vs control;▲▲P<0.01 vs 4 Gy.圖3 細胞周期結(jié)果

        討 論

        Tet又名粉防己堿,為千金藤屬植物粉防己塊根中的主要成分,化學(xué)結(jié)構(gòu)為雙芐基異喹啉生物堿,分子式為C33H42N2O6。Tet為非選擇性鈣通道拮抗劑,具有降壓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗纖維化、降血糖等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)Tet具有抗腫瘤作用,表現(xiàn)為直接抗腫瘤、增加放射敏感性、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多重耐藥和抗血管形成[8-10]。已有的研究提示Tet的抗腫瘤作用機制主要通過抑制CDK/cyclin E和CDK4轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抑制CDK4、CDK6、cyclin D1和E2F1蛋白降解、抑制p53/p21Cip1的表達等途徑,誘導(dǎo)腫瘤細胞阻滯于G1期[5]。

        作為一個理想的放射增敏劑(radiation sensitizing agents,RAS),應(yīng)該具備如下特點:(1)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易和其它物質(zhì)反應(yīng);(2)有效劑量沒有毒性或毒性很低;(3)易溶于水,便于給藥;(4)專對腫瘤細胞,特別是對腫瘤乏氧細胞有較強的放射增敏作用;(5)有較長的生物半衰期,并在體內(nèi)能保持其藥物毒性,足以滲入整個腫瘤;(6)在常規(guī)分次治療,較低的藥物劑量即可有放射增敏作用;而關(guān)于抗腫瘤藥物用于增敏研究的劑量選擇,經(jīng)驗用量為抗腫瘤藥物 IC50的 1/10 ~1/5[11]。

        本研究在探討Tet對CNE1和CNE2細胞IC50的基礎(chǔ)上,進一步通過MTT實驗得出Tet對CNE1和CNE2細胞的最大非細胞毒性劑量,分別為1.5 μmol/L 和 1.8 μmol/L,采用此劑量研究 Tet的放射增敏作用較以往的經(jīng)驗用量更為科學(xué)、可信。

        已有文獻證實放射線照射可導(dǎo)致細胞DNA雙鏈斷裂、細胞周期阻滯于G2期,并啟動一系列DNA損傷修復(fù)機制防止在M期進行異常分裂,以對抗放射線損傷[12-13]。本研究中,流式細胞術(shù)提示單純放射線照射能顯著增加2株細胞的G2期細胞比例(P<0.05),而Tet聯(lián)合放射線照射與單純放射線照射相比,G2期細胞比例明顯降低(P<0.01);MTT法與克隆形成實驗結(jié)果提示Tet聯(lián)合放射線照射能顯著抑制細胞增殖、增加細胞對放射線的敏感性,放射增敏比分別為1.73和1.40(P <0.05)。因此,我們推測Tet去除放射線照射誘導(dǎo)的G2期細胞阻滯可能是其放射增敏的機制之一。由于細胞在G2期能完成DNA損傷修復(fù),而Tet可能導(dǎo)致尚未進行DNA修復(fù)的細胞直接進入下一周期,表現(xiàn)為G2期細胞比例減少,損傷后的細胞在進入到下一周期后不能正常生長而死亡,從而達到放射增敏作用。

        綜上所述,最大非細胞毒性劑量的Tet對人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2具有放射增敏作用,其機制可能與去除放射線照射誘導(dǎo)的G2期細胞阻滯有關(guān)。

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