劉明啟，戴賢君，白蘭芳

（中國計(jì)量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

果膠由酯化程度不同的半乳糖醛酸以α－1，4糖苷鍵聚合而成的，并含有木糖、海藻糖、半乳糖等側(cè)鏈的一類雜多糖.果膠酶（pectinase）是指能夠降解果膠一系列酶的總稱，主要包括聚半乳糖醛酸 酶（PG）、果膠裂解酶（PL）、果膠酯酶（PE）［1，2］.果膠酶是世界四大工業(yè)用酶制劑之一，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、生物制漿、紡織工業(yè)和飼料工業(yè).內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶（endo－polygalacturonase，EC.3.2.1.15）作用于果膠主鏈內(nèi)部的2個(gè)非酯化半乳糖醛酸間的α－1，4糖苷鍵，是果膠最關(guān)鍵的水解酶之一，也是果膠酶中最早被人們所認(rèn)識(shí)和應(yīng)用最廣泛的一類.質(zhì)量最好的果膠來自于柑橘水果類，2010年浙江省柑橘的種植面積為169.3萬畝，柑橘產(chǎn)量為192萬噸，多年居全國第一位，果膠資源非常豐富，具有以果膠為原料生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的優(yōu)勢.

果膠經(jīng)內(nèi)切聚半乳糖醛酸特異性降解所得產(chǎn)物為聚合度不等的果膠低聚糖（POS，DP：2－10）和低分子果膠（MCP，DP：20－50）.POS是公認(rèn)的功能性添加劑，具有特異性增殖雙歧桿菌和乳酸菌、有效用量最小、熱量低、穩(wěn)定性好、感觀性好等特性［3-7］.低分子果膠（MCP）具有重要的生理功能，主要表現(xiàn)為抗腫瘤作用，增強(qiáng)免疫功能，改善肥胖和降低血脂水平，輔助排毒［8-10］.低分子果膠和果膠低聚糖雖然廣泛存在柑橘膠質(zhì)中，但含量很低，采用直接提取方法生產(chǎn)成本高，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的商品化生產(chǎn)；然而固定化內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶結(jié)合酶反應(yīng)器為大規(guī)模制備POS和MCP提供了可能性.

果膠酶在實(shí)際應(yīng)用過程存在諸多不足之處，如：由野生菌種分泌到胞外的蛋白種類多，增加了果膠酶分離純化的難度，故目前商品化野生型果膠酶純度較低；果膠酶活性偏低，導(dǎo)致催化水解效率偏低；現(xiàn)在市場上銷售的果膠酶多為內(nèi)切酶、裂解酶及果膠酯酶的混合物，缺少專一適用于制備POS、MCP的商品化內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶［11，12］.黑曲霉（Aspergillus niger JL－15）為本實(shí)驗(yàn)室前期篩選的酶高產(chǎn)菌株，它主要產(chǎn)果膠酶、木聚糖酶、淀粉酶和葡聚糖酶［13］.本研究采用 RT－PCR方法，克隆到黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因（pgaA），并在大腸桿菌中獲得分泌表達(dá)，有助于獲得適用于制備POS、MCP的重組內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑曲霉JL－15（Aspergillus niger JL－15）菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離，其孢子于－20℃保存.Escherichia coli Rosetta－gami B（DE3）、pET－32a（＋）購于Novagen；pUCm－T vector System、總 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒和DNA Marker購于上海生工生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和割膠回收純化試劑盒購于Axygen；T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa；酵母膏、蛋白胨購于Oxoid；其余常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純.

1.2 黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因（pgaA）的RT－PCR

根據(jù)GenBank中已登錄的真菌內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：P1，5′－TCAG＾AATTCATGCCTTCTGCCAAGCCTTTGT－3′，P2，5′－CAT GC＾GGCCGCTTACT－GATCGCAAGAAGCAC－3′，并在上下游引物中分別引入EcoRI和NotI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn).

將A.niger JL－15接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，150r／min培養(yǎng)48h，收集菌絲于滅菌后的濾紙上，吸干，再將菌絲置于滅菌后的研缽中，經(jīng)液氮冷凍，碾磨；然后采用Trizol法提取黑曲霉總RNA［14］，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA.以cDNA為模板，P1和P2為引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件如下：94℃，4min；94 ℃，50s；62.6 ℃，50s；72 ℃，2min，循環(huán)34次；72 ℃，10min.PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳分析，并割膠回收目的條帶，回收產(chǎn)物與pUCm－T vector連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCm－T－pgaA，測定核苷酸序列.

1.3 黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因（pgaA）在大腸桿菌中的表達(dá)

重組質(zhì)粒pUCm－T－pgaA 經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切，電泳，割膠回收的目的片段，定向插入酶切后的表達(dá)載體pET－32a（＋）中，并轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta－gami B（DE3），轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg／L氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12h，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定.將陽性克隆子接種于LB液體培養(yǎng)基中（100mg／L氨芐青霉素），37℃、150r／min培養(yǎng)至A600＝0.8左右，加IPTG（終濃度1mmol／L）30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，離心，取上清液測定果膠酶活性.

1.4 重組黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A（rePGA）活性測定和SDS－PAGE

聚半乳糖醛酸酶活性測定采用DNS法［15］，果膠酶活力單位（U）定義為：在最適反應(yīng)條件下，以每1min生成1μmol還原糖（以D 半乳糖醛酸計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶活力單位.蛋白質(zhì)濃度的測定采用Bradford法，牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白［16］.選用不同底物濃度測定果膠酶活性，采用雙倒數(shù)作圖法求米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vmax）［17］.

重組黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A（rePGA）的SDS－PAGE分析參照Laemmli報(bào)道的方法［18］，濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和15%.以pET－32a（＋）轉(zhuǎn)化菌為對照，陽性表達(dá)子和對照菌株經(jīng)培養(yǎng)，離心收集菌體，加5×SDSPAGE電泳上樣緩沖液，100℃煮沸10min，離心，取上清液，等量蛋白上樣.

1.5 溫度對rePGA活性的影響及其熱穩(wěn)定性

測定rePGA在30～90℃下的活性，以確定其最適溫度.rePGA在30～90℃下分別保溫4min，然后冰浴5min，在最適條件下測定酶活，以未經(jīng)熱處理的rePGA在最適條件下的酶活為對照，計(jì)算殘余酶活.

1.6 pH對rePGA活性的影響及其穩(wěn)定性

分別用pH 3.0～9.0的緩沖液配制果膠底物，測定果膠酶活性，確定rePGA最適pH.將rePGA酶液pH分別調(diào)為pH3.0～9.0，在25℃條件下保溫1h，然后在最適條件下測定酶活，計(jì)算rePGA的殘余酶活.

1.7 金屬離子對rePGA活性的影響

分別向rePGA酶液中添加CaCl2、MgSO4、CuSO4、ZnSO4、MnSO4、FeCl3、KCl和 AlCl3，各種金屬離子的終濃度均為5.0mmol／L，在25℃下處理1h，計(jì)算rePGA殘余酶活.

1.8 水解過程中果膠溶液粘度和還原糖的變化

以400mL 4.0%的果膠為底物，添加4.0mL的rePGA酶液（110U），在28℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用Brookfield DV－I Prime測定反應(yīng)體系的粘度變化，選用S 02號(hào)轉(zhuǎn)子，100r／min轉(zhuǎn)速；每間隔5min取樣測定反應(yīng)體系的還原糖濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因（pgaA）的克隆及序列分析

從黑曲霉菌絲體中提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明在1100bp大小附近存在特異條帶（圖1）.測序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物序列全長為1113bp，與黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因（pgaA）理論長度一致，為一個(gè)完整的開放閱讀框（ORF），編碼370個(gè)氨基酸殘基（圖2），所編碼蛋白的理論相對分子質(zhì)量為38800Da，pgaA與Genbank已登錄的黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因（CAB72125）的同源性為99%.

圖1 黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因（pgaA）PCR擴(kuò)增Figure 1 Electrophoresis of pgaAfromA.niger

2.2 pgaA在大腸桿菌中的表達(dá)及SDS－PGAE分析

重組表達(dá)質(zhì)粒pgaA－pET－32a（＋）Vector經(jīng)EcoRI、NotI雙酶切后電泳，顯示切出與目的基因大小一致的DNA片段（圖3），表明克隆載體含有pgaA序列.pgaA－pET－32a（＋）Vector轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta－gami B（DE3），挑取重組子于LB中，37℃培養(yǎng)12h，然后添加IPTG誘導(dǎo)，陽性子BL21pgaA7發(fā)酵上清液中的果膠酶活性最高，為637.0U／mg，分別高于黑曲霉深層發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的活性和重組Burkholderia cepacia 果膠酶的活性［［19，20］.

SDS－PAGE 結(jié)果表明，與對照相比，BL21pgaA7在40000Da附近存在特異性條帶（圖4），計(jì)算出的相對分子質(zhì)量為40500Da，與理論值40000Da相近.酶促動(dòng)力學(xué)研究表明，rePGA的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vmax）分別為4.05mg／mL和39.37μmol／（mL·min）（圖5），與野生型黑曲霉JL－15果膠酶的Km和Vmax相似.

圖2 黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因序列及編碼的氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequences of pgaAand the deduced amino acid sequences

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pgaA－pET－32a（＋）Vector雙酶切鑒定Figure 3 Digestion of pgaA－pET－32a（＋）Vector

圖4 重組大腸桿菌BL21pgaA7表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE分析Figure 4 SDS－PAGE of BL21pgaA7

2.3 溫度對rePGA活性的影響及其熱穩(wěn)定性

圖5 rePGA的酶促動(dòng)力學(xué)Figure 5 Michaelis－Menten kinetics of rePGA

在不同溫度下，重組黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶（rePGA）的活性變化較大，在60℃時(shí)，酶活性達(dá)到最大值（圖6），在70℃～80℃范圍內(nèi)，酶活性迅速降低.熱穩(wěn)定性研究表明，rePGA在低于50℃條件下較穩(wěn)定，50℃處理5min，其殘余酶活為64.37%.在高于65℃條件下，重組酶活性穩(wěn)定性迅速下降，80℃處理5min后，其殘余酶活僅為14.18%（圖6）.

圖6 溫度對rePGA活性的影響及其熱穩(wěn)定性Figure 6 Optimum temperature and thermostability of rePGA

2.4 pH對rePGA活性的影響及其穩(wěn)定性

在不同pH條件下，rePGA活性發(fā)生明顯變化，在pH 5.0時(shí)酶活性達(dá)到最大值（圖7），rePGA在酸性條件下活性較高，為嗜酸性酶.pH穩(wěn)定性研究表明，重組酶在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，25℃處理30min，其殘余酶活均在70%以上（圖7）.

圖7 pH對rePGA活性的影響及其pH穩(wěn)定性Figure 7 Optimum pH and pH stability of rePGA

2.5 金屬離子對rePGA活性的影響

8種常見金屬離子對重組酶活性的影響各異（圖8）.Ca2＋對rePGA酶活具有顯著促進(jìn)作用，經(jīng)過1h處理，果膠酶活性是對照組的為137.95%.Fe3＋、Mg2＋、Mn2＋、Al3＋對rePGA的活性具有明顯抑制作用，處理后的殘余酶活分別是對照組的14.36%、0.89%、58.1%、70.2%，其它2種金屬離子對rePGA活性無顯著影響.Ca2＋對米曲霉JL－14果膠酶活性無顯著影響［21］，但對枯草芽孢桿菌JL－13果膠酶活性有顯著的促進(jìn)作用［22］.Mn2＋對米曲霉JL－14果膠酶和Mucor rouxii果膠酶活性均有顯著促進(jìn)作用［23］.

圖8 金屬離子對rePGA活性的影響Figure 8 Effect of metal ions on rePGA activity

2.6 水解過程中果膠溶液粘度和還原糖的變化

rePGA能快速降低果膠溶液的粘度并使反應(yīng)體系的還原糖濃度升高（圖9）.反應(yīng)前期的粘度降低幅度顯著高于反應(yīng)后期，而還原糖濃度的變化則是反應(yīng)前期小于反應(yīng)后期，該結(jié)果與rePGA的內(nèi)切作用模式相符，經(jīng)過30min水解rePGA使果膠溶液的粘度降低了72%，還原糖的質(zhì)量濃度增加到11.2mg／mL.米曲霉果膠酶經(jīng)過30min水解作用使橘皮果膠溶液的粘度降低了80%［18］，粘度降低的幅度高于rePGA的作用效果.

圖9 水解過程中底物粘度與還原糖質(zhì)量濃度的變化Figure 9 Change in viscosity and concentration of reducing sugars during hydrolysis of pectin by rePGA

3 結(jié) 語

目前商品化果膠酶生產(chǎn)菌株多為野生真菌菌株或突變選育菌株，實(shí)驗(yàn)室前期分離到多株果膠酶高產(chǎn)菌株，并對其發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，但野生型菌株分泌的雜蛋白較多，增加了果膠酶分離純化的難度.構(gòu)建高產(chǎn)果膠酶基因工程菌，可以使繁瑣的酶蛋白分離純化變得簡單快捷，也有助于獲得專一性的內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶.本研究采用RT－PCR的方法克隆到黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A基因（pgaA），該基因ORF全長1113bp，編碼370個(gè)氨基酸殘基；pgaA定向插入表達(dá)載體pET－32a（＋）中，在E.coli獲得分泌表達(dá)，重組黑曲霉內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶A（rePGA）最高活性為637.0U／mg，相對分子質(zhì)量約為40500Da，Km和Vmax分別為4.05mg／mL 和39.37μmol／（mL·min）.rePGA 的最適溫度為60℃，最適pH為pH 5.0.rePGA能快速降低果膠溶液的粘度，符合其內(nèi)切作用模式特點(diǎn)，表明其初步具備適用于制備POS和MCP的特性.

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