白 林，郭興道，任 韡（.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心藥檢室，北京 00853；.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000）

腎樂膠囊為解放軍總醫(yī)院非標(biāo)制劑，由水蛭、陳皮等五味中藥材加工制成，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)血、健脾利濕的功效，常用于慢性腎小球腎炎，證屬氣虛血瘀夾水濕者。方中陳皮味辛、苦，性溫，入脾、肺經(jīng)，其功能為理氣健脾，燥濕化痰[1]。陳皮中含多種揮發(fā)油及黃酮類物質(zhì)[2]，尚未建立其含量測(cè)定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)采取HPLC法對(duì)腎樂膠囊中陳皮的主要成分橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，此法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為有效控制腎樂膠囊的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司，含四元梯度泵、自動(dòng)脫氣機(jī)、VWD檢測(cè)器和化學(xué)工作站）；CX-300型超聲波清洗機(jī)（北京市天海雙龍醫(yī)療器械有限責(zé)任公司）；UV-2550型紫外分光光度儀（日本島津）。

橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110721-200613）；甲醇為色譜純；水：重蒸水。腎樂膠囊（解放軍總醫(yī)院，規(guī)格：0.45 g/粒，批號(hào)100601，101215，110512）。

2 方法

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），甲醇-水（40∶60）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm，柱溫為35 ℃，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算不低于3000[3]。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液：取橙皮苷對(duì)照品約0.013 35 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得儲(chǔ)備液（0.534 mg·mL-1）；精密量取上述儲(chǔ)備液2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（42.72 μg·mL-1）。

供試品溶液：取裝量差異項(xiàng)下的腎樂膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理[4]30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

陰性空白對(duì)照液：按處方比例稱取除陳皮以外的其余藥味，按腎樂膠囊制備工藝制成缺陳皮的陰性空白對(duì)照液，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺陳皮陰性空白對(duì)照液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，色譜圖見圖1。

圖1 橙皮苷色譜圖Fig 1 Chromatograms of Hesperidin

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.534 mg·mL-1）0.16，0.32，0.64，1.28，1.6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度并搖勻，得到濃度分別為8.544，17.09，34.18，68.35，85.44 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y= 17.026 4X+ 2.667 3，r= 0.999 9。結(jié)果表明，橙皮苷在8.544 ～85.44 μg·mL-1時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按上述色譜條件，精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積值，平均值為765.2，RSD為0.12%（n= 5）。說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取本品（批號(hào)100601）粉末，按供試品溶液方法制備供試品溶液，按色譜條件檢測(cè)，精密吸取供試品溶液10 μL，注入色譜儀，共進(jìn)樣5次，記錄峰面積，平均值為548.88，RSD為0.19%（n= 5）。表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取本品（批號(hào)100601）粉末，按供試品溶液方法制備供試品溶液，按色譜條件，精密吸取供試品溶液10 μL，分別在0，4，8，12，16，24 h進(jìn)樣。記錄峰面積值，平均值為514.05，RSD為1.26%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

取6份已知含量的腎樂膠囊（批號(hào)100601）內(nèi)容物適量，每份約1 g，研細(xì)，精密稱定，分別加入編號(hào)1～6的具塞錐形瓶中，分別精密加2 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液（濃度0.534 mg·mL-1）和48 mL甲醇，按供試品溶液制備方法，依色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為101.6%，RSD為0.54%（n= 6），說(shuō)明本方法的回收率良好，具體見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Tab 1 Results of recovery test

2.9 樣品含量測(cè)定

三批腎樂膠囊，批號(hào)分別為100601、101215、110512，取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物適量，按供試品溶液的制備及色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，橙皮苷含量分別為2.76，2.83，2.67 mg·g-1（n= 3）。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

對(duì)照品溶液曾用30%乙醇作為溶劑[5]，較難溶解，且放置過(guò)程中溶液混濁。后采用甲醇做溶劑，使該問題解決且超聲可加速溶解，放置過(guò)程中穩(wěn)定性好，峰面積無(wú)明顯差異。供試品溶液用甲醇做溶劑比30%乙醇溶解性好，并且經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較提取率高。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，最大吸收波長(zhǎng)為283 nm，靈敏度高、無(wú)其他雜質(zhì)峰干擾。

3.3 流動(dòng)相的選擇

以甲醇-水（25∶75）[6]、甲醇-水（40∶60）分別作為流動(dòng)相進(jìn)行比較，結(jié)果甲醇-水（40∶60）時(shí)，出峰時(shí)間適宜，峰形較好，無(wú)干擾。

3.4 不同批次樣品含量的比較

本實(shí)驗(yàn)對(duì)橙皮苷含量測(cè)定具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，方法專屬性強(qiáng)，不存在其他組分干擾。三個(gè)批次的樣品平均含量為2.75 mg·g-1，RSD =2.9%。說(shuō)明在此加工工藝的條件下，橙皮苷含量較穩(wěn)定，可檢測(cè)橙皮苷含量作為檢測(cè)腎樂膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 李慶耀，梁生林.陳皮的藥用研究進(jìn)展[J].中成藥，2008，30（2）：246-248.

[2] 鄭小吉，詹曉如，王小平.陳皮研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2007，9（10）：30-33.

[3] 敖輝，涂海龍.HPLC法測(cè)定蛇膽陳皮膠囊中橙皮苷的含量[J].江西中醫(yī)藥，2008，39（12）：75-76.

[4] 喻明潔，呂圭源， 陳素紅.橙皮苷提取分離及檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7（5）：171-173.

[5] 謝東，路玫.HPLC法同時(shí)測(cè)定風(fēng)寒感冒片中葛根素和橙皮苷的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009，25（1）：28-30.

[6] 楊華，何希榮，顧雪竹.HPLC 測(cè)定膽疏膠囊中橙皮苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（10）：92-93.