李秀國，張民鋒，樸日龍，李迎軍

(延邊大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2藥學(xué)院，吉林 延吉 133002)

觀察心肌收縮力、心率和心輸出量等心肌機(jī)械活動(dòng)的變化，以及監(jiān)測心電圖的變化對于研究各種生理或病理因素對心臟功能的影響，以及心血管藥物的開發(fā)具有重要意義?，F(xiàn)有很多觀察心臟功能的實(shí)驗(yàn)方法，都有各自的特點(diǎn)。離體Langendorff心臟灌流法、離體乳頭肌實(shí)驗(yàn)法、心房肌實(shí)驗(yàn)法等能夠模擬哺乳動(dòng)物心肌收縮，兔在體不破壞胸膜記錄心收縮力的方法能夠同時(shí)觀察心肌收縮力和心電圖的變化，但實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)條件要求較高［1－2］。利用變溫動(dòng)物離體心臟為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行的Straub's法和八木－Hartung法蛙心插管［3］能夠直觀地觀察整體心臟收縮，具有簡單、易行，不需恒溫和供氧設(shè)備，心臟活動(dòng)不受神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)。宋士軍等［4］的實(shí)驗(yàn)方法利用在體蟾蜍心臟同步觀察了心臟的機(jī)械性活動(dòng)和心電圖的變化。在同一實(shí)驗(yàn)個(gè)體中能夠同步觀察多個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)不僅能夠減少實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)更可靠。本實(shí)驗(yàn)制作了蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟灌注模型，用于同步監(jiān)測心輸出量、心肌舒縮張力和心電圖。通過灌注β受體激動(dòng)藥異丙腎上腺素和其拮抗藥普萘洛爾，驗(yàn)證了該實(shí)驗(yàn)方法的可行性。

材料和方法

1 材料

蟾蜍，雌雄混用，體質(zhì)量50～70 g，延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。BL－420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和張力換能器以及標(biāo)準(zhǔn)肢體心電圖Ⅱ?qū)?lián)線(四川成都泰盟科技有限公司)，異丙腎上腺素、普萘洛爾(Sigma Chemical Co.)，任氏液為標(biāo)準(zhǔn)配方。

2 方法

2.1 模型制備(圖1) 蟾蜍毀腦毀髓，背位固定在蛙板上。打開胸腹腔，暴露心臟和相連大血管。分離左右主動(dòng)脈干，結(jié)扎右主動(dòng)脈，左主動(dòng)脈穿線備用。上提左右主動(dòng)脈，鈍性分離后腔靜脈，并在其下穿2條線，1條從靜脈竇下方結(jié)扎后腔靜脈和動(dòng)脈干以外的其它血管，1條備用。向左翻開肝臟右葉，分離肝靜脈并輕輕提起，將裝有任氏液的連接三通管和5 mL注射器的硅膠管(外徑2 mm，內(nèi)徑1.5 mm)從肝靜脈經(jīng)后腔靜脈插入右心房約1.5～2.0 mm。打開三通管，并注入少量任氏液，進(jìn)一步確定硅膠管進(jìn)入位置。用備用絲線結(jié)扎固定插入后腔靜脈的硅膠管頭端(注意保持管道的通暢，不能有扭曲或反折，以免影響液體流出)。在三通管的垂直入口上連接儲(chǔ)液瓶(10 mL注射器管制成)，打開儲(chǔ)液瓶與注射器之間的通道，推注注射器內(nèi)的任氏液進(jìn)入儲(chǔ)液瓶，排出三通管內(nèi)殘留氣體。打開儲(chǔ)液瓶與硅膠管之間的通道，向后腔靜脈輸入任氏液清洗心臟積血。將肝臟和心臟放回原位。提起左主動(dòng)脈干，做一“V”形切口。將另一個(gè)硅膠管從切口向心臟方向插入至近動(dòng)脈圓錐處，用備用絲線結(jié)扎固定(硅膠管尖端平切，利于液體流出)?；厥樟鞒鲆褐羶?chǔ)液瓶。用無創(chuàng)蛙心夾夾住心尖并與張力換能器連接。調(diào)節(jié)儲(chǔ)液瓶液面高度(前負(fù)荷)為3 cmH2O，流出管口高度(后負(fù)荷)為10 cmH2O。觀察液體流出量，確定有無漏液。向蟾蜍右側(cè)頭端牽拉結(jié)扎左右腔靜脈等的絲線并固定，調(diào)節(jié)蛙心夾與滑輪的水平連線，使蟾蜍心尖保持水平向下偏左。肢體皮下插入針狀電極，利用BL－420S系統(tǒng)記錄心臟的張力和標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。穩(wěn)定30 min，調(diào)節(jié)張力換能器，使心肌在舒張期末的張力維持在1.0 g左右。待蟾蜍心臟收縮曲線平穩(wěn)后，記錄心輸出量、心肌舒縮程度和幅度，以及心電圖PR間期、QT間期、QRS波群電壓和時(shí)間等，作為自身對照。

Figure 1.A schematic diagram simultaneously detecting the cardiac contractility and electrocardiogram(ECG)on the separated in situ spontaneously beating toad heart perfusion model.a:container for perfusion;b:3－way stopcock;c:syringe for rapid application of Ringer's solution or empty the gas in the inflow cannula;d:inflow cannula;e:aortic cannula(outflow cannula);f:force transducer;g:standard limb leadⅡ;h:BL－420S data acquisition and analysis system.圖1 同步監(jiān)測蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟灌流模型的機(jī)械性和電活動(dòng)示意圖

2.2 利用灌流模型觀察異丙腎上腺素對心臟活動(dòng)的影響在對照條件下，用10－5g/L異丙腎上腺素溶液置換儲(chǔ)液瓶中的任氏液，待曲線平穩(wěn)后，記錄以上參數(shù)。之后，依次用5×10－5g/L、10－4g/L異丙腎上腺素溶液置換儲(chǔ)液瓶中液體，在曲線平穩(wěn)時(shí)記錄以上參數(shù)。

2.3 利用灌流模型觀察普萘洛爾對異丙腎上腺素作用的影響 用含10－4g/L異丙腎上腺素和含10－4g/L普萘洛爾的混合溶液置換10－4g/L異丙腎上腺素溶液，在曲線平穩(wěn)時(shí)記錄以上參數(shù)。之后依次用含10－4g/L異丙腎上腺素與含5×10－4g/L和10－3g/L普萘洛爾混合溶液置換后，在曲線平穩(wěn)時(shí)記錄以上參數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 離體原位心臟機(jī)械性活動(dòng)和相應(yīng)心電圖表現(xiàn)

在灌注任氏液的條件下，蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟張力和心電圖曲線見圖2，具體參數(shù)見表1。通過記錄出液管中的流出滴數(shù)，方便地記錄到心輸出量的變化(1 mL=20 drop);通過張力曲線圖能夠監(jiān)測到心臟收縮和舒張程度、舒縮幅度;心電圖曲線中的PR間期、QT間期、QRS波群時(shí)間和電壓等顯示清楚，利于分析心臟機(jī)械性活動(dòng)和電生理變化的相關(guān)性。

Figure 2.The curves of cardiac force and electrocardiogram simultaneously recorded from the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve;B:ECG curve.圖2 同步記錄蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟的張力和心電圖曲線

表1 普萘洛爾對異丙腎上腺素所致的蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟活動(dòng)的影響Table 1.The effects of isoproterenol on the cardiac activities of the separated in situ toad hearts in the presence or absence of propranolol(.n=10)

表1 普萘洛爾對異丙腎上腺素所致的蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟活動(dòng)的影響Table 1.The effects of isoproterenol on the cardiac activities of the separated in situ toad hearts in the presence or absence of propranolol(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs pretreatment;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 10－4g/L isoproterenol.

Parameters Pretreatment isoproterenol(g/L)10－4g/L isoproterenol+propranolol(g/L)10－5 5×10－5 10－4 10－4 5×10－4 10－3 Cardiac output(mL/min) 2.66±0.78 2.99±0.64＊＊ 3.43±0.37* 3.62±0.32* 3.04±0.48△△ 2.37±0.76△△ 1.89±0.79△△Maximum force(g) 1.91±0.25 1.95±0.32 1.98±0.33 2.13±0.42 1.70±0.19△△ 1.50±0.19△△ 1.38±0.16△△Minimum force(g) 0.98±0.03 0.93±0.04＊＊ 0.81±0.05＊＊ 0.78±0.07＊＊ 0.76±0.05 0.78±0.06 0.79±0.07 Force range(g) 0.93±0.26 1.01±0.34 1.17±0.35 1.35±0.43＊＊ 0.94±0.19△△ 0.72±0.19△△ 0.59±0.17△△PR interval(ms) 323.33±54.49 305.00±57.28 ＊＊ 284.44±41.64＊＊ 283.89±48.98＊＊ 300.56±49.90 346.67±59.63△△ 371.11±59.57△△QRS width(ms) 160.00±14.58 168.33±27.39 162.78±18.73 174.44±21.42 175.00±22.91 186.11±20.43 202.22±18.05△△QT interval(ms) 772.22±205.97 793.89±193.71 991.11±210.64* 1082.78±220.77＊＊ 927.33±232.16△ 771.67±186.21△△ 744.44±144.86△△R wave amplitude(mV) 0.056±0.024 0.063±0.032 0.061±0.023 0.073±0.028* 0.061±0.025△ 0.046±0.015△△ 0.037±0.015△△R and S wave amplitude(mV) 0.089±0.038 0.103±0.054 0.144±0.155 0.114±0.036* 0.099±0.039△ 0.082±0.025△△ 0.076±0.023△△Heart rate(min－1) 30.20±6.79 30.98±6.24 28.91±5.69 30.16±6.56 30.76±6.25 27.30±4.32 24.72±3.70△

2 異丙腎上腺素對離體原位心臟活動(dòng)和心電圖的影響

離體原位心臟灌流模型中，異丙腎上腺素對心臟活動(dòng)和心電圖的影響見圖3、表1。與給藥前相比較，在10－5～10－4g/L濃度范圍內(nèi)，隨著異丙腎上腺素濃度的增加，心輸出量逐漸增多(P＜0.05，P＜0.01)，最大張力逐漸增大，最小張力逐漸變小(P＜0.01)，心肌舒縮幅度逐漸變大(10－4g/L時(shí)，P＜0.05)。在心電圖中表現(xiàn)為，心率無顯著變化，但PR間期逐漸縮短(P＜0.01)，QT間期逐漸延長(P＜0.05，P＜0.01)，R波和 R+S波電壓逐漸增大(10－4g/L時(shí)，P＜0.05)。

3 普萘洛爾對異丙腎上腺素作用的影響

離體原位心臟灌流模型中，普萘洛爾對異丙腎上腺素作用的影響見表1、圖4。與10－4g/L異丙腎上腺素作用相比較，在10－4～10－3g/L濃度范圍內(nèi)，隨著普萘洛爾濃度的增加，心輸出量逐漸減少(P＜0.01)，最大張力逐漸變小(P＜0.01)，最小張力無明顯變化，心肌舒縮幅度明顯變小(P＜0.01)。在心電圖中表現(xiàn)為，心率逐漸變慢(10－3g/L時(shí)，P＜0.05)，PR間期逐漸延長(P＜0.01)，QRS波群時(shí)間逐漸延長(10－3g/L時(shí)，P＜0.01)，QT間期逐漸變小(P＜0.05，P＜0.01)，R波和R+S波電壓逐漸變小(P＜0.05，P＜0.01)。

Figure 3.Effects of isoproterenol on the cardiac force and ECG of the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve.B:ECG curve;a:perfused with 10－5g/L isoproterenol;b:perfused with 5 ×10－5g/L isoproterenol;c:perfuse with 10 －4g/L isoproterenol.圖3 異丙腎上腺素對蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟張力和心電圖曲線的影響

Figure 4.Effects of propranolol on isoproterenol(10－4g/L)－induced cardiac activities of the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve.B:ECG curve;a:perfused with 10 －4g/L isoproterenol and 10 －4g/L propranolol mixture;b:perfused with 10－4g/L isoproterenol and 5 ×10－4g/L propranolol mixture;c:perfused with 10－4g/L isoproterenol and 10 －3g/L propranolol mixture.圖4 普萘洛爾對異丙腎上腺素所致的蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟活動(dòng)的影響

討 論

本實(shí)驗(yàn)利用蟾蜍離體原位自發(fā)性搏動(dòng)心臟模型同步監(jiān)測了灌注正常生理鹽溶液條件下的心輸出量、心肌舒縮張力和心電圖。如圖2所示，通過心臟搏動(dòng)張力曲線能夠記錄到心臟節(jié)律性舒縮程度、幅度和節(jié)律，標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖波形曲線可記錄到P波、QRS波群的幅度和時(shí)間、PR間期和QT間期等;2種曲線同時(shí)監(jiān)測，利于分析二者間的相關(guān)性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與宋士軍等［4］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，能夠觀測到心房和心室的搏動(dòng)波，且P波和QRS波群早于心房收縮波和心室收縮波。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流入管和流出管管徑大小對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響;管道過細(xì)導(dǎo)致液體循環(huán)受阻，影響心臟功能，過粗不利于插管，易導(dǎo)致手術(shù)失敗。經(jīng)參照McKean等［5］的方法和反復(fù)實(shí)驗(yàn)，流出管和流入管均用了外徑2 mm和內(nèi)徑1.5 mm的硅膠管。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體重在50～70 g之間的蟾蜍心臟耐受性較好。40 g以下或100 g以上易出現(xiàn)心臟增大變形、心率減慢、心律不齊，甚至出現(xiàn)房室瓣關(guān)閉不全導(dǎo)致液體逆流等現(xiàn)象。心電圖是從體表記錄到的心臟在每一心動(dòng)周期所產(chǎn)生的電活動(dòng)變化曲線圖形。由體表所采集到的心電位強(qiáng)度，與探查電極的方位和心肌除極或復(fù)極方向所構(gòu)成的角度有關(guān);夾角愈大，心電位在某導(dǎo)聯(lián)軸上的投影愈小，電位愈弱。心尖和探查電極的位置相對固定，利于得到相對穩(wěn)定的心電圖波形。由于受各種因素的影響，暴露的蟾蜍心尖所處的位置并不完全一致。為使得到的心電圖相對穩(wěn)定，易于記錄各波的幅值，在本實(shí)驗(yàn)過程中要求:(1)蛙心夾的系線應(yīng)盡量水平牽拉，使心臟不離開胸腔;(2)將系線拉向蟾蜍的左后肢方向，并用結(jié)扎左右腔靜脈等的結(jié)扎線拉向與之反向的蟾蜍頭部右上方。這樣得到的心電圖中各種波形明顯，QRS波群的主波方向向上，利于監(jiān)測各個(gè)波形振幅和間期;同時(shí)，可以防止左右主動(dòng)脈因受牽拉變形導(dǎo)致灌流液流出受阻。

通過灌注β受體激動(dòng)藥異丙腎上腺素和其拮抗藥普萘洛爾發(fā)現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍軌蜉^好地顯示異丙腎上腺素的正性肌力作用和普萘洛爾的拮抗作用。在灌注異丙腎上腺素時(shí)，隨著其濃度的增加，心輸出量逐漸增多，收縮張力逐漸增大，舒張張力逐漸變小，舒縮幅度逐漸變大，顯示了異丙腎上腺素不僅使心肌收縮力增強(qiáng)，同時(shí)使舒張程度增加的作用。在心電圖中表現(xiàn)為PR間期逐漸縮短，QT間期逐漸延長，QRS波群時(shí)間無明顯變化，即房室傳導(dǎo)加快，心臟的舒張期相對延長，進(jìn)一步證實(shí)了異丙腎上腺素能夠使心室舒張程度增加。與鄭廣華等［6］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，異丙腎上腺素對一些蟾蜍心臟具有正性頻率作用，而對其它蟾蜍心臟無正性頻率作用，統(tǒng)計(jì)結(jié)果未顯示正性頻率作用。在灌注異丙腎上腺素和普萘洛爾混合溶液時(shí)，隨著普萘洛爾濃度的增加，心輸出量逐漸減少，收縮程度逐漸減小，心肌舒縮幅度明顯變小，顯示出其對異丙腎上腺素的拮抗作用。心電圖中表現(xiàn)為心率逐漸變慢，PR間期逐漸延長，QRS波群時(shí)間逐漸延長，QT間期逐漸變小，進(jìn)一步證實(shí)了其拮抗作用。

通過灌注異丙腎上腺素和普萘洛爾發(fā)現(xiàn)有趣的一點(diǎn):用異丙腎上腺素置換任氏液后，隨著異丙腎上腺素濃度的增加，R波和R+S波電壓逐漸變大;而在灌注異丙腎上腺素和普萘洛爾混合溶液時(shí)，R波和R+S波電壓逐漸變小。這種現(xiàn)象與心臟機(jī)械性收縮過程中的舒縮幅度的變化趨勢相似，見圖3、4。心電圖是通過放置在體表的電極記錄到心臟電活動(dòng)圖形，而心臟收縮由心肌細(xì)胞電活動(dòng)所引發(fā)。在一定的初長度下，工作細(xì)胞可通過增加粗肌絲上活化的橫橋數(shù)目來增強(qiáng)心肌收縮力?；罨臋M橋在全部橫橋中所占的比例決定于興奮時(shí)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的濃度和(或)肌鈣蛋白對Ca2+的親和力。兩棲類的心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)很不發(fā)達(dá)［7］，ryanodine受體幾乎難以找到［8］，心肌收縮主要依賴細(xì)胞外鈣內(nèi)流。異丙腎上腺素可通過cAMP轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活細(xì)胞膜上的L型鈣通道，增加Ca2+內(nèi)流，使心肌收縮力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中蟾蜍心尖拉向左后肢標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)的正極方向，而異丙腎上腺素能夠使心臟舒張程度增大，導(dǎo)致心室在舒張期與心電圖正極之間的距離變小。由于心電圖QRS波群振幅大小與正電極和心室間距離的平方成反比［9］，異丙腎上腺素引起的心室與正極之間的距離變小可能引起QRS振幅變大。具體原因有待進(jìn)一步證實(shí)。

由于本實(shí)驗(yàn)方法能夠用簡單的設(shè)備和材料同時(shí)監(jiān)測心臟機(jī)械性活動(dòng)和電活動(dòng)過程，具有簡單、有效而且經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，對于心臟的生理、病理生理和藥理學(xué)研究，以及醫(yī)學(xué)生在機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)的綜合性、設(shè)計(jì)性和探索性實(shí)驗(yàn)研究等有一定的參考價(jià)值。

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