田河林，韋立順，許忠新，康艷輝，趙如同，金東嶺

(河北工程大學醫(yī)學院，河北 邯鄲 056029)

糖尿病微血管病變是糖尿病常見而嚴重的并發(fā)癥，是導致糖尿病患者生存質(zhì)量下降的主要原因。新生血管的形成在糖尿病微血管病變的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管新生的主要促進因子［1］。微血管密度(microvessel density，MVD)是反映血管生成的生物指標，白細胞分化抗原CD34在血管內(nèi)皮細胞有強陽性表達，是目前檢測微血管的可靠標記［2］。VEGF在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用研究較為廣泛，VEGF在糖尿病腎病中的作用近年來日益受到關注。有關糖尿病腎小球VEGF表達與微血管密度關系的研究國內(nèi)外鮮有報道。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導糖尿病小鼠模型，應用免疫組織化學方法觀察CD34和VEGF在糖尿病小鼠腎小球的表達，探討MVD與VEGF表達的關系，為糖尿病微血管病變的發(fā)病機制和干預措施提供依據(jù)。

材料和方法

1 動物

清潔級昆明種小鼠，雄性，30～35 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(冀)2008－1－008。

2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素購自Alexis;CD34單抗、VEGF單抗、SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。血糖儀及血糖試紙購自艾康生物技術(杭州)有限公司;CX41型Olympus顯微鏡。

3 主要方法

3.1 糖尿病模型建立與分組 所有動物飼養(yǎng)于室溫、12 h光/暗條件下，喂以鼠全價顆粒飼料，自由飲水，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。將小鼠禁食(不禁水)12 h，稱重，尾尖取血測空腹血糖。實驗前用pH 4.4檸檬酸緩沖液將鏈脲佐菌素配成1%溶液。造模小鼠1次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(pH 4.5)150 mg/kg;對照組小鼠腹腔注射等容量檸檬酸緩沖液。72 h后測空腹血糖，空腹血糖高于16.7 mmol/L確定為造模成功糖尿病小鼠［3］。取糖尿病小鼠和正常對照小鼠各18只，分別飼養(yǎng)于鼠籠中，每籠6只。

3.2 標本采集與免疫組化染色 每周定時測量1次小鼠空腹體重與血糖，連續(xù)觀察6周。分別于第2、4、6周從糖尿病組和對照組中隨機抽取各6只小鼠，腹腔注射烏拉坦(1 g/kg)麻醉，摘取腎臟，以10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，分別作HE染色和免疫組化染色。CD34及VEGF染色采用鏈酶親和素－過氧化物酶(streptavidin－peroxidase，SP)法，操作步驟按SP試劑盒說明書進行。3%H2O2室溫孵育，抗原熱修復，常規(guī)免疫組化標記，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。用PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。

3.3 結果觀察與判斷 取HE染色切片進行組織形態(tài)學觀察，采用組織細胞病理分析軟件進行計量學測定，在400倍視野下測量腎小球直徑、周長和面積，每張切片取5個腎小球，取其平均值。血管內(nèi)皮細胞漿呈棕黃色染色為CD34染色陽性，單個血管內(nèi)皮細胞或細胞簇染色陽性判定為1個微血管;在400倍視野下取5個腎小球計數(shù)微血管數(shù)目，取其平均值作為微血管密度值。細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGF表達陽性，按細胞染色強度計分(a):淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;按顯色細胞百分率計分(b):≤30%細胞顯色1分，31% －60%細胞顯色2分，≥61%細胞顯色3分;將2項得分的積作為VEGF表達指數(shù)(VEGF index)，即VEGF index=a×b［4］;在400倍視野下觀察，每張切片取5個腎小球，取其平均值作為VEGF index值。

4 統(tǒng)計學處理

結 果

1 一般狀況

對照組小鼠活動與精神狀態(tài)良好。糖尿病組小鼠活動減少，精神萎靡;攝食、飲水及排尿量明顯增多(數(shù)據(jù)略)，空腹血糖明顯高于對照組(P＜0.01)，見表1;造模后小鼠體重逐漸下降，第4、6周時體重顯著低于對照組(P＜0.01)，見表2。

表1 對照組與糖尿病組小鼠血糖水平變化Table 1.Changes of blood glucose level in control and diabetic mice(mmol/L.n=6)

表1 對照組與糖尿病組小鼠血糖水平變化Table 1.Changes of blood glucose level in control and diabetic mice(mmol/L.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 6.8 ±1.3 7.0 ±2.0 7.5 ±2.0 7.2 ±2.3 Diabetic 6.5 ±1.4 27.1 ±2.3＊＊26.5 ±2.7＊＊28.6 ±3.0＊＊

表2 對照組與糖尿病組小鼠體重變化Table 2.Changes of body weight in control and diabetic mice(g..n=6)

表2 對照組與糖尿病組小鼠體重變化Table 2.Changes of body weight in control and diabetic mice(g..n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

＊＊Control 36.2 ±2.2 38.5 ±2.1 40.2 ±2.8 42.3 ±2.6 Diabetic 37.1 ±2.6 36.7 ±2.3 32.4 ±3.0＊＊31.5 ±2.2

2 組織形態(tài)學

鏡下可見，糖尿病組小鼠腎小球明顯肥大，腎小球毛細血管數(shù)目增多，血管擴張，細胞外基質(zhì)增多;腎髓質(zhì)部分腎小管上皮細胞水腫，管腔擴張，內(nèi)皮細胞數(shù)目增多，見圖1。組織細胞計量學測定結果表明，糖尿病組小鼠腎小球直徑、周長和面積均顯著大于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，見表3。

Figure 1.Histomorphological changes in glomeruli of control(A)and diabetic(B)mice 6 weeks after treatment(HE staining，×400).圖1 HE染色顯示對照組和糖尿病組小鼠腎小球組織形態(tài)學變化

表3 對照組與糖尿病組小鼠腎小球直徑、周長及面積變化Table 3.Changes of diameter，perimeter and area of glomeruli in control and diabetic mice(.n=6)

表3 對照組與糖尿病組小鼠腎小球直徑、周長及面積變化Table 3.Changes of diameter，perimeter and area of glomeruli in control and diabetic mice(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 48.8 ±8.3 49.0 ±8.7 50.1 ±9.1 19.1 ±3.3 19.1 ±3.1 19.0 ±4.0 20.1 ±7.2 20.1 ±6.2 20.3 ±7.2 Diabetic 56.7 ±9.2 72.3 ±8.5＊＊ 80.6 ±8.9＊＊ 23.5 ±3.5* 29.2 ±3.5＊＊ 31.2 ±3.9＊＊ 31.2 ±8.6* 50.4 ±10.2＊＊51.1 ±11.3＊＊

3 微血管密度與VEGF表達

與對照組相比，糖尿病組小鼠腎小球CD34染色在第2周時無明顯差異，第4周和第6周CD34染色明顯增強，見圖2，腎小球MVD顯著增大(P＜0.01)，見表4;糖尿病組小鼠腎小球VEGF表達在第2周時亦無明顯變化，第4周和第6周VEGF表達增強，見圖3，VEGF指數(shù)顯著高于對照組(P＜0.01)，見表4。相關性分析結果表明，糖尿病小鼠MVD值與VEGF 表達指數(shù)存在顯著正相關(r=0.9979，P ＜0.05)。

討 論

糖尿病是危害人類生命健康的慢性代謝性疾病，實驗性糖尿病動物模型的建立，不僅對研究糖尿病的病因和發(fā)病機制具有重要意義，而且為研究降糖藥作用機制及篩選降糖藥提供實驗依據(jù)。糖尿病動物模型大體分為實驗性、自發(fā)性和轉(zhuǎn)基因糖尿病模型，目前國內(nèi)外應用較多的是注射STZ誘導的實驗性糖尿病動物模型。本實驗采用一次性腹腔注射STZ法，建立糖尿病小鼠模型。成模后小鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿及體重減輕等癥狀，其空腹血糖明顯高于16.7 mmol/L，且高血糖狀態(tài)持續(xù)至第6周而不下降，與文獻報道成模癥狀相符［5］。

Figure 2.Immunohistochemistry showed CD34 expression in glomeruli of control(A)and diabetic(B)mice 6 weeks after treatment(SP staining，×400).圖2 免疫組化染色顯示CD34在對照組和糖尿病組小鼠腎小球的表達

Figure 3.Immunohistochemistry showed VEGF expression in glomeruli of control(A)and diabetic(B)mice 6 weeks after treatment(SP stainning，×400).圖3 免疫組化染色顯示VEGF在對照組和糖尿病組小鼠腎小球的表達

表4 對照組與糖尿病組小鼠腎小球微血管密度及VEGF表達Table 4.Changes of MVD and VEGF expression of glomeruli in control and diabetic mice(.n=6)

表4 對照組與糖尿病組小鼠腎小球微血管密度及VEGF表達Table 4.Changes of MVD and VEGF expression of glomeruli in control and diabetic mice(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

VEGF index 2 weeks 4 weeks 6 weeks 2 weeks 4 weeks 6 weeks Control 14.1 ±2.2 14.6 ±2.9 15.2 ±2.6 2.4 ±1.2 2 Group MVD.4 ±1.1 2.5 ±1.3 Diabetic 16.3 ±2.7 21.7 ±2.4＊＊ 25.3 ±2.5＊＊ 3.6 ±1.4 6.1 ±1.5＊＊ 8.2 ±1.6＊＊

組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠腎小球明顯肥大，腎小球直徑、周長及面積顯著大于對照組小鼠;并出現(xiàn)細胞外基質(zhì)增多，腎小管上皮細胞水腫、管腔擴張等現(xiàn)象。高糖一直被認為是導致糖尿病腎臟形態(tài)及功能異常的主要原因，其機制之一是糖基化終產(chǎn)物的大量形成和聚積，引起腎小球多種細胞增生，導致腎小球肥大、細胞外基質(zhì)增多和腎小球硬化;高糖還可能通過增加多元醇途徑活性、增加組織氧化應激過程或減少細胞外基質(zhì)降解等多種途徑造成組織損害［6－7］。

免疫組化染色顯示，糖尿病小鼠腎小球CD34表達明顯增強，第4周后其微血管密度顯著高于正常對照組;同時，糖尿病小鼠腎小球VEGF表達顯著高于正常對照組。目前認為，多種細胞因子參與了糖尿病微血管病變的發(fā)生與發(fā)展過程，其中VEGF與糖尿病腎臟病變有密切聯(lián)系。VEGF是一種內(nèi)皮細胞特異性絲裂原，廣泛分布于人和動物肝、腎、眼等多種組織，以旁分泌形式作用于內(nèi)皮細胞相應受體，可刺激內(nèi)皮細胞的增殖與分化，參與生理性和病理性新生血管形成，并增加微血管的通透性［8－9］。在糖尿病狀態(tài)下，高糖、糖基化終末產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化生長因子β等多種因素均可促使VEGF的合成與分泌，VEGF表達的上調(diào)導致內(nèi)皮細胞功能障礙和血管病變［10］。

VEGF在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用已經(jīng)明確，眼內(nèi)VEGF水平高低與新生血管形成及視網(wǎng)膜病變嚴重程度密切相關。本研究結果發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠腎小球新生血管生成增多，微血管密度增大，且與腎小球VEGF表達呈顯著正相關。在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，VEGF在糖尿病早期(第3周)腎小球的表達即顯著增高［11］。臨床資料顯示，早期糖尿病患者腎小球上皮細胞VEGF表達上升;糖尿病患者血中VEGF水平較健康對照組和無微血管并發(fā)癥患者明顯增高［12］。顯然，VEGF表達上調(diào)與糖尿病腎臟微血管病變密切相關［13］。研究表明，高糖可誘導大鼠腎系膜細胞、牛視網(wǎng)膜細胞和人血管平滑肌細胞VEGF表達上調(diào)，其機制可能是通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)依賴途徑實現(xiàn)的，PKC抑制劑和VEGF抗體則可改善糖尿病腎臟病變［14－15］。

綜上所述，STZ誘導糖尿病小鼠腎小球明顯擴張，腎小球微血管密度顯著增加，且與腎小球VEGF表達呈顯著正相關，提示糖尿病腎臟病變與VEGF表達上調(diào)密切相關，抗VEGF治療可能成為糖尿病腎微血管病變新的防治措施。

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