聶 穎，張維溪， 崇 蕾，王 婷， 李昌崇

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院呼吸科，浙江 溫州 325027)

T淋巴細胞在支氣管哮喘(簡稱哮喘)氣道炎癥中發(fā)揮著核心作用。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)和輔助性 T 細胞 17(T helper 17 cells，Th17)是來源于共同初始T細胞的兩類輔助性T細胞，它們在分化和功能上均有相互抑制作用，促炎作用的Th17和抑炎作用的Treg細胞的失衡可以誘導(dǎo)哮喘等免疫性疾病的發(fā)生［1-2］。磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是一類特異性催化磷酯醇(phosphatidylinositol，PI)3位羥基磷酸化，產(chǎn)生肌醇酯質(zhì)產(chǎn)物的激酶。研究表明，PI3K參與哮喘的慢性氣道炎癥過程，在哮喘T細胞的活化、分化及細胞因子的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要作用［3-4］。本實驗通過建立BALB/c哮喘小鼠模型，體外培養(yǎng)T細胞，在細胞水平研究PI3K信號能否影響Treg/Th17失衡，并檢測Treg/Th17分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和RORγt，及特異性分泌因子白細胞介素(interleukin，IL)-10、IL-17的表達變化，探討PI3K信號通路是否參與Treg/Th17失衡的調(diào)節(jié)。

材料和方法

1 主要試劑

雞卵清蛋白(ovalbumin，OVA，Sigma)，植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA，Sigma);白細胞介素 2(Cinterleukin-2，IL-2)(上海華新生物技術(shù)有限公司);紅細胞裂解液(Solarbio);RPMI-1640(Gibco);胎牛血清(杭州四季青公司);尼龍毛(Kisker);流式主要抗體:兔抗小鼠 CD4T細胞 -FITC(eBioscience);兔抗小鼠CD25T細胞-PE(eBioscience);IL-10 ELISA kit(R＆D Systems);IL-17 ELISA kit(R＆D Systems);Trizol(Invitrogen);逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(Fermentas);引物(上海基康公司合成);PI3K抑制劑LY294002(Sigma)。

2 動物

SPF級雄性BALB/c小鼠，4～6周，體重18～22 g，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學(xué)院SPF級實驗動物中心。

3 哮喘動物模型的建立［5］

第1 d和第13 d經(jīng)小鼠腹腔注射0.01%OVA/Al(OH)3混合液 0.1 mL［內(nèi)含 OVA 10 μg 和Al(OH)3凝膠20 mg］致敏，第25 d至第32 d，每天將小鼠置于5 L密閉容器中，以1%OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)，使小鼠暴露在OVA氣霧中45 min，由噴射霧化器霧化。對照組小鼠，以生理鹽水代替OVA。于末次激發(fā)后12 h內(nèi)頸椎脫臼處死，取脾臟以備T細胞培養(yǎng)所用。

4 小鼠脾臟原代T細胞的分離及純度和存活率的檢測

無菌分離對照組和哮喘組BALB/c小鼠脾臟細胞，200目尼龍膜過濾。加入紅細胞裂解液破紅，PBS液洗滌2次，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，接種25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 h，除去貼壁細胞，調(diào)整細胞濃度為1×1011/L，加入尼龍毛柱中孵育60 min，除去與尼龍毛結(jié)合的B淋巴細胞，收集T淋巴細胞。采用流式細胞儀檢驗?zāi)猃埫诌x后T細胞的純度。以0.4%臺盼藍對T細胞進行染色，觀察細胞存活率，細胞存活率按下式計算:細胞存活率(%)=(染色陰性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

5 T細胞分組培養(yǎng)及干預(yù)

分別將對照組和哮喘組BALB/c小鼠的T淋巴細胞用含10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整T細胞濃度(1×109/L)，分別鋪于24孔，各為1 mL的細胞懸液，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，按以下2組方案進行體外干預(yù):對照組(A組)分為2個亞組:空白對照組 A1(對照組T淋巴細胞+PBS 5 μL)，PI3K抑制劑對照組A2(對照組T淋巴細胞+LY29400220 μmol/L);哮喘組(B組)繼續(xù)分為4個亞組:哮喘組B1(哮喘組T淋巴細胞+PBS 5 μL)，5 μmol/L PI3K 抑制劑組 B2(哮喘組 T淋巴細胞 +LY2940025 μmol/L)，10 μmol/L PI3K抑制劑組B3(哮喘組T淋巴細胞+LY29400210 μmol/L)，20 μmol/L PI3K 抑制劑組B4(哮喘組T淋巴細胞 +LY29400220 μmol/L)，各組均加入 10 mg/L PHA和1×106U/L IL-2與細胞共培養(yǎng)6 h后，實驗組各孔按上述分組加入干預(yù)劑，空白對照組加入等體積培養(yǎng)液，72 h后收獲細胞。

6 Treg細胞比例的測定

收集 A1、A2、B1、B2、B3、B4 各組的細胞 1 ×106個，PBS洗滌1次，各管分別加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的CD4單克隆抗體20 μL，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD8單克隆抗體20 μL，避光孵育30 min，PBS洗2次。用流式細胞儀檢測，每個樣品測定10000個細胞，分析CD4和CD8的雙陽性細胞數(shù)來確定各檢測管中Treg細胞的表達比例。

7 各組T細胞上清液中IL－10和IL－17水平的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)法檢測，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

8 各組T細胞中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和RORγt mRNA表達水平的檢測

采用RT-PCR法檢測。細胞勻漿并用Trizol法抽提RNA，繼之根據(jù)試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進行Foxp3、RORγt和β-actin產(chǎn)物擴增。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，將反應(yīng)物94℃預(yù)變性5 min后，94℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)32次，72℃ 10 min，見表1。用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件進行圖像分析，計算目的產(chǎn)物熒光強度與β-actin產(chǎn)物熒光強度比值，作為Foxp3和RORγt mRNA的相對表達量。

表1 各對引物序列及擴增條件Table 1.Primer sequence and amplification conditions

9 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。采用單因素方差分析對各組進行分析，方差齊性者采用SNK法進行多重比較;方差不齊性者采用Dunnett's T3;相關(guān)性分析采用Spearman分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠脾臟細胞分選后T細胞的純度和存活率

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，運用尼龍毛柱法分離后獲得的T細胞，純度達到(74.12±3.08)%，T細胞的存活率分別為(92.82±3.21)%，其中1次結(jié)果見圖1。

多年來的退田還湖是值得肯定的。盡管如此，武昌湖周邊圩區(qū)仍然是主要農(nóng)耕區(qū)，提高圩區(qū)防洪能力是治水主要措施。為什么不能繼續(xù)退田還湖？既然洪澇威脅性大，不如退地求湖，改變利用方式，以退為進。

Figure 1.Purity of T cells in splenocytes after separation.A:negative control;B:T cell ratio in splenocytes.圖1 脾臟T細胞的純度分析

2 各組中Treg細胞比例的變化

Treg細胞比例B1組［(3.57±0.35)%］顯著低于A1組［(8.93±0.74)%］(P＜0.01);A2組［(14.73±1.75)%］顯著高于A1組(P＜0.05);B3組［(5.63±0.46)%］和B4組［(7.08±0.40)%］顯著高于 B1組(均 P＜0.01);B2組［(4.53±0.40)%］與 B1組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2、圖2 ～4。

表2 各組T細胞中CD4+CD25+Treg細胞百分比Table 2.The percentage of CD4+CD25+Treg from each group(%..n=4)

表2 各組T細胞中CD4+CD25+Treg細胞百分比Table 2.The percentage of CD4+CD25+Treg from each group(%..n=4)

△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs A1 group;★★P ＜0.01 vs B1 group;▲P ＜0.05 vs B3 group.A1:T cells from normal mice;A2:PI3K inhibitor-treated T cells from normal mice;B1:T cells from asthma mice;B2:5 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B3:10 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B4:20 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group.

Group CD4+CD25+Treg A1 8.93±0.74 A2 14.73±1.75△B1 3.57 ±0.35△△B2 4.53±0.40 B3 5.63 ±0.46★★B4 7.08±0.40★★▲

Figure 2.Flow cytometric analysis of CD4+CD25+Treg from blank control group and asthma group.A:A1 group;B:B1 group.A1:T cells from normal mice;B1:T cells from normal mice.圖2 空白對照組與哮喘組CD4+CD25+Treg細胞流式分析圖

Figure 3.Flow cytometric analysis of CD4+CD25+Treg from blank control group and PI3K inhibitor control group.A:A1 group;B:A2 group.A1:T cells from normal mice;A2:PI3K inhibitor-treated T cells from normal mice.圖3 空白對照組與PI3K抑制劑對照組CD4+CD25+Treg細胞流式分析圖

3 各組中T細胞上清液中IL－10和IL－17的含量變化

Figure 4.Flow cytometric analysis of CD4+CD25+Treg from different groups.A:B1 group;B:B2 group;C:B3 group;D:B4 group;B1:T cells from asthma mice;B2:5 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B3:10 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B4:20 μmol/L PI3K inhibitortreated T cells from asthma group.圖4 哮喘各干預(yù)組CD4+CD25+Treg細胞流式分析圖

IL-17水平B1組［(51.01±3.33)ng/L］顯著高于A1組［(19.65±1.74)ng/L］(P＜0.01);A2組［(12.29±1.34)ng/L］顯著低于A1組(P＜0.01);B2組［(43.56±1.72)ng/L］、B3組［(32.36±1.78)ng/L］和 B4組［(26.92±1.38)ng/L］顯著低于 B1組(均P＜0.01)，且呈藥物濃度依賴性下降;與之相反，IL-10水平B1組［(12.46±1.65)ng/L］顯著低于A1組［(57.47±1.72)ng/L］(P＜0.01);A2組［(71.36±5.42)ng/L］顯著高于 A1組(P＜0.01);B2組［(21.23±3.86)ng/L］、B3組［(35.73±4.53)ng/L］和 B4組［(38.73±6.11)ng/L］顯著高于 B1組(均P＜0.01);且呈藥物濃度依賴性增高，見表3。

表3 各組T細胞上清液中IL－10和IL－17的水平Table 3.Levels of IL-10 and IL-17 in T cells from different groups(ng/L..n=8)

表3 各組T細胞上清液中IL－10和IL－17的水平Table 3.Levels of IL-10 and IL-17 in T cells from different groups(ng/L..n=8)

△△P ＜0.01 vs A group;★★P ＜0.01 vs B1 group;●●P ＜0.01 vs B2 group;▲▲P ＜0.01 vs B3 group.A1:T cells from normal mice;A2:PI3K inhibitor-treated T cells from normal mice;B1:T cells from asthma mice;B2:5 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B3:10 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B4:20 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group.

A1 57.47±1.72 19.65±1.74 A2 71.36±5.42△△ 12.29±1.34△△B1 12.46±1.65△△ 51.01±3.33△△B2 21.23±3.86★★ 43.56±1.72★★B3 35.73±4.53★★●● 32.36±1.78★★●●B4 38.73±6.11★★●● 26.92±1.38★★●●▲▲

4 各組T細胞中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA和RORγt mRNA表達變化

RORγt mRNA表達 B1組(0.31±0.06)顯著高于A1組(0.08±0.02)(P＜0.01);A2組(0.05±0.01)顯著低于 A1組(P＜0.05);B2組(0.22±0.04)、B3組(0.15±0.04)和B4組(0.09±0.03)顯著低于 B1組(分別為 P ＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，且呈藥物濃度依賴性降低。Foxp3 mRNA表達B1組(0.40±0.11)顯著低于A1組(1.22±0.32)(P＜0.01);A2組(1.44±0.28)顯著高于 A1組(P＜0.01);B2組(0.57±0.08)、B3組(0.82±0.22)和B4組(1.04±0.31)均顯著高于B1組(分別為P＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01)，見圖 5。

Figure 5.The expression of Foxp3，RORγt mRNA and RORγt/Foxp3 in different groups.M:DNA marker;A1:T cells from normal mice;A2:PI3K inhibitor-treated Tcells from normal mice;B1:T cells from asthma mice;B2:5 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B3:10 μmol/L PI3K inhibitor-treated T cells from asthma group;B4:20 μmol/L PI3K inhibitortreated T cells from asthma group..n=8.△P＜0.05，△△P ＜0.01 A1 group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs B1 group.圖5 各組T細胞組轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和RORγt mRNA的表達

5 各組T細胞中轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA/Foxp3 mRNA比值的變化

B1組RORγt mRNA/Foxp3 mRNA(0.83±0.26)顯著高于A1組［(0.07±0.02)］(P＜0.01);A2組［(0.04±0.01)］顯著低于A1組(P＜0.01);B2組(0.37±0.11)、B3組(0.18±0.05)和B4組(0.10±0.04)顯著低于B1組(均P＜0.01)，且呈濃度依賴性降低，見圖5。

6 RORγt mRNA/Foxp3 mRNA的比值與細胞因子IL－10和IL－17表達水平相關(guān)關(guān)系分析

RORγt mRNA/Foxp3 mRNA的比值與 Th17特異性細胞因子IL-17的分泌呈正相關(guān)(r=0.89，P＜0.01)，而與Treg特征性細胞因子IL-10的分泌呈負相關(guān)(r=-0.86，P ＜0.01)。

討 論

T淋巴細胞是哮喘主要效應(yīng)細胞之一。Th17和Treg細胞的生物學(xué)功能和分化過程相拮抗，促炎的Th17細胞和抑炎的Treg細胞相互制約以維持體內(nèi)的免疫平衡。一旦Th17/Treg平衡失調(diào)，出現(xiàn)Th17優(yōu)勢反應(yīng)，出現(xiàn)異常免疫反應(yīng)導(dǎo)致哮喘等免疫性疾病的發(fā)生［1-2］。

Treg細胞是CD4+T細胞的一個重要亞型，通過細胞間的接觸及分泌抑制性細胞因子(如IL-10或TGF-β等)來發(fā)揮免疫抑制作用［2］。有研究表明［6］，哮喘患者體內(nèi)Treg細胞的數(shù)量和功能都出現(xiàn)下降，與本實驗結(jié)果一致。同時我們的研究還表明，PI3K抑制劑LY294002在對照組和哮喘組內(nèi)均介導(dǎo)了活化T細胞向Treg的分化，且在哮喘組內(nèi)隨著PI3K抑制濃度的增加Treg細胞逐漸增加，其結(jié)果提示PI3K信號通路通過對Treg細胞功能的調(diào)節(jié)而參與哮喘的發(fā)病過程，與 Liu 等［7］和 Patton 等［8］報道一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組較對照組脾臟T細胞中RORγt mRNA水平顯著增高，伴隨Th17的效應(yīng)性細胞因子IL-17表達增高;而Foxp3 mRNA的表達明顯降低，伴隨Treg相關(guān)因子 IL-10表達下降，且RORγt/Foxp3比值增高，提示哮喘發(fā)生的可能機制與Th17/Treg失衡導(dǎo)致的免疫絮亂有關(guān)。

Sauer等［14］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K 信號抑制劑通過調(diào)節(jié)TCR/CD28活化信號而參與Foxp3的誘導(dǎo)生成。我們在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，PI3K信號不僅影響Foxp3的表達而且對RORγt的表達也具有顯著作用。本實驗應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002對哮喘T細胞進行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，隨著干預(yù)劑濃度的增加，F(xiàn)oxp3 mRNA的表達及IL-10水平逐漸增高;而RORγt mRNA及IL-17水平明顯下降，且RORγt/Foxp3比例逐漸下降，各水平的變化呈濃度依賴性，且在對照組內(nèi)變化與哮喘組一致，表明PI3K信號通路對哮喘Th17/Treg失衡起著調(diào)控作用。

總之，本實驗證實哮喘小鼠T淋巴細胞中存在Th17/Treg失衡，而PI3K信號通路參與Th17/Treg失衡的調(diào)節(jié)，其機制可能是PI3K信號特異性抑制劑上調(diào)了特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達而間接抑制了RORγt的表達，使RORγt/Foxp3的表達優(yōu)勢發(fā)生改變，進而減輕Th17優(yōu)勢分化，使免疫失衡減輕，表現(xiàn)為其代表性細胞因子IL-10的升高和IL-17的下降。進一步深入研究PI3K信號通路與Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)機制，將為哮喘提供新的治療靶點。

［1］Awasthi A，Murugaiyan G，Kuchroo VK.Interplay between effector Th17 and regulatory T cells［J］.J Clin Immunol，2008，28(6):660-670.

［2］Palomares O，Yaman G，Azkur AK，et al.Role of Treg in immune regulation of allergic diseases［J］.Eur J Immunol，2010，40(5):1232-1240.

［3］Deane JA，F(xiàn)ruman DA.Phosphoinositide 3-kinase:diverse roles in immune cell activation［J］.Annu Rev Immunol，2004，22(1):563-598.

［4］Ghigo A，Damilano F，Braccini L，et al.PI3K inhibition in inflammation:Toward tailored therapies for specific diseases［J］.Bioessays，2010，32(3):185-196.

［5］張維溪，李昌崇，程曉明，等.哮喘小鼠支氣管MIP-1α、RANTES基因和蛋白的表達［J］.中國病理生理雜志，2004，20(5):858-861.

［6］Hartl D，Koller B，Mehlhorn AT，et al.Quantitative and functional impairment of pulmonary CD4+CD25hiregulatory T cells in pediatric asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2007，119(5):1258-1266.

［7］Liu D，Zhang T，Marshell AJ，et al.The p110δ isoform of phosphatidylinositol 3-kinase controls susceptibility to Leishmania major by regulating expansion and tissue homing of regulatory T cells［J］.J Immunol，2009，183(3):1921-1933.

［8］Patton DT，Garden OA，Pearce WP，et al.Cutting edge:the phosphoinositide 3-kinase p110 delta is critical for the function of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells［J］.J Immunol，2006，177(10):6598-6602.

［9］Sakaguchi S.Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self［J］.Nat Immunol，2005，6(4):345-352.

［10］Ivanov II，McKenzie BS，Zhou L，et al.The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+T helper cells［J］.Cell，2006，126(6):1121-1131.

［11］Ichiyama K，Yoshida H，Wakabayashi Y，et al.Foxp3 inhibits RORγt-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORγt［J］.J Biol Chem，2008，283(25):17003-17008.

［12］Zhou L，Lopes JE，Chong MM，et al.TGF-β-induced Foxp3 inhibits TH17 cell differentiation by antagonizing RORγt function［J］.Nature，2008，453(7192):236-240.

［13］Ziegler SF，Buckner JH.FOXP3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation［J］.Microbes Infect，2009，11(5):594-598.

［14］Sauer S，Bruno L，Hertweck A，et al.T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K，Akt and mTOR［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(22):7797-7802.