齊素文，涂植光△，戴 勇，睢維國

(1教育部臨床檢驗診斷學重點實驗室，重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院，重慶 400016;2中國人民解放軍181醫(yī)院全軍腎移植與透析治療中心，廣西 桂林 541002)

表觀遺傳機制對免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能發(fā)揮具有重要作用，外界因素的影響使表觀遺傳在免疫反應中出現(xiàn)不平衡可致基因異常表達，免疫功能紊亂，從而導致自身免疫性疾病的發(fā)生。表觀遺傳的兩個主要機制為DNA甲基化和組蛋白修飾，進而對染色質結構的改變、基因轉錄和復制產(chǎn)生重要影響。DNA甲基化和組蛋白修飾之間也存在相互作用［1，2］。為此，我們采用染色質免疫共沉淀聯(lián)合芯片(chromatin immunoprecipitation linked to microarrays，ChIP－chip)技術對 IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)患者的組蛋白H3賴氨酸4三甲基化進行研究，采用甲基化 DNA免疫共沉淀熒光定量 PCR(methylated DNA immunoprecipitation－quantitative PCR，MeDIP－qPCR)方法檢測陽性基因的DNA甲基化水平，以探討IgAN中組蛋白H3K4三甲基化和DNA甲基化的相關性，從基因水平研究IgAN的發(fā)病機制。

材料和方法

1 臨床資料

收集2008年10月～2010年7月在中國人民解放軍181醫(yī)院腎病中心收治的IgA腎病患者40例，參考HAAS分級法［3］進行診斷。其中女性25例，男性15 例，年齡(48.6 ±9.3)歲，HAAS III級20 例、IV級10例、V級10例。正常對照組40例，女性25例，男性15例，年齡(45.2 ±10.6)歲。本研究計劃經(jīng)重慶醫(yī)科大學倫理會批準，所有受試對象簽署了知情同意書。

2 主要試劑

淋巴細胞分離液(Cedarlane)，12K CpG島芯片(UHN Microarray Centre)，組蛋白H3賴氨酸4三甲基化抗體(Millipore);整個基因組擴增試劑盒(Qiagen)，蛋白酶 K(Epigentek)，5－甲基胞嘧啶抗體(Upstate)，磁珠偶聯(lián)Ⅱ抗(Upstate)，QIA快速PCR純化試劑盒(Invitrogen)，EpiQuikTMH3K4三甲基化定量試劑盒(Epigentek)，Sss I甲基轉移酶(New England Biolabs);固體閃爍劑 MicroScint 20(Millipore);［3H］－S－腺苷甲硫氨酸(［3H］－SAM)(Sigma)。

3 單個核細胞分離

每例患者和健康者空腹抽取10 mL外周靜脈血，使用肝素鈉抗凝。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離采用 Ficoll密度梯度離心法，按照淋巴細胞分離液試劑盒的產(chǎn)品說明進行操作。收集得到的單個核細胞分裝成3份，1份用于染色質免疫共沉淀芯片實驗，1份加1 mL Trizol用于總RNA的提取，1份用于DNA甲基化實驗。于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 ChIP－chip

采用試劑盒對受試對象進行總體H3K4三甲基化水平檢測。ChIP－chip步驟基本參照文獻［4］并略作修改。在室溫條件下，用1%甲醛處理PBMCs 10 min，使組蛋白和DNA發(fā)生交聯(lián)，再用0.125 mol/L甘氨酸在室溫下處理5 min終止交聯(lián)反應。用預冷1×PBS 10 mL清洗細胞2次后，300 μL溶解緩沖液(10 mmoL/L Tris－HCl pH 8.0;100 mmoL/L NaCl;1 mmoL/L乙二胺四乙酸pH 8.0;0.1%脫氧膽酸鈉和蛋白酶抑制劑)重懸細胞，并在冰上孵育30 min，超聲處理細胞懸液4 min。隨后在4℃下離心10 min，棄上清，獲得PBMCs片狀碎屑物溶解液，分裝為3份，第1份與H3K4三甲基化抗體進行免疫沉淀反應;第2份和第3份分別作為內(nèi)參(input contro1)和陰性對照(negative control)，在第1份溶解液和陰性對照中加入50 μL磁珠并在4℃孵育1 h，使用低鹽、高鹽、氯化鋰溶液和TE緩沖液洗滌，隨后加熱65℃，5 h解交聯(lián)、RNase A和proteinase K消化，酚氯仿抽提DNA。然后進行DNA擴增并對擴增產(chǎn)物進行純化。Cy3或Cy5熒光基團標記ChIP DNA和Input DNA，作為芯片雜交的熒光探針與12K CpG島芯片進行雜交，使用GenePix 4000B芯片掃描儀(Axon Instruments)掃描芯片，使用Genespring分析軟件分析原始數(shù)據(jù)。

5 CHIP－qPCR

ChIP步驟與上述 ChIP－chip一樣。采用ABI7700 real－time PCR儀對免疫沉淀的DNA、input control和negative control進行擴增。設計陽性基因擴增引物序列(Primer 5.0軟件設計)。FCRL4基因:5'－TTGGAGTAATAGTGCCCAGCA －3'，5'－TAGTCCCCAGAAGCCTCAGT － 3'，286bp;SERPINB7基因:5'－TACAAGCTAGTTTTACTTTTTTGTTAAGCA － 3'，240 bp;5'－ TCAAGTACTCAAAAGTGCCTCAT－3';PTPRN2基因:5'－GTGACATTACAGAGCCCCGT － 3'，5' － TTATTCCCCAGAGCGCCTTT－3'，180 bp;MBP 基因:5'－AAGCAAACAGCTTCACAAATTCTC －3'，5'－ ACTTAATTCTGAGTAAGCAAGACATACAAC － 3'，240 bp。測定標準曲線和熔解曲線，確保擴增的準確性和專一性，用Ct(threshold cycle)值表示樣品中模板的相對含量，采用 2－ΔΔCt法［5］進行分析。

6 熒光qRT－PCR

用Trizol試劑提取RNA并測定RNA濃度值，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。設計陽性基因和內(nèi)參基因(GAPDH)擴增引物序列。FCRL4基因:5'－CTCTGACTTGCAATGGATTTCAG － 3'，5' － CCAAGTATATTTCACAGCAGTCAA － 3'，139 bp;SERPINB7基因:5'－TCCATTTTGCAATGGCCT －3'，5'－ TATCAGAAAAAACTCTTTTCAGTTGAGAC － 3'，270 bp;PTPRN2基因:5'－ GCCAGAAGGTTCCGGCAAT －3'，5'－ CAGGTAGGTTTTCGGGAGGT －3'，170 bp;MBP 基因:5'－ CACACCAAGGGAGACCATGT － 3'，5'－CCTTTTTGGCCCTTTGGTCC － 3'，300 bp;GAPDH 基因:5'－ CCATGGAGAAGGCTGGGG － 3'，5'－CAAAGTTGTCATGGATGACC －3'，250 bp。測定標準曲線和熔解曲線，確保擴增的準確性和專一性，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，采用 2－ΔΔCt法［5］進行分析。

7 MeDIP－qPCR

采用Sss I甲基轉移酶法(methyl accepting assay/methyl group acceptance assay)對受試對象進行總體DNA甲基化水平分析［6］。具體操作步驟如下:基因組 DNA 1 μL，Sss I酶(4 ×106U/L)1 μL，10 × NE buffer 22 μL，［3H］－ SAM(1.6 mmol/L)12 μL，三蒸水14 μL，混勻，37℃孵育 1 h。然后65℃孵育20 min終止反應。將反應混合液加到96孔板，洗去未結合DNA的［3H］－SAM;取出板底座，每孔加入閃爍液100 μL，在Microbeta液閃儀上檢測每個孔的每分鐘脈沖數(shù)(counts/min)，計算整體基因組甲基化率。MeDIP－qPCR具體實驗步驟如下:吸取1.5 mL的裂解緩沖液至冷凍的細胞管中，用移液器吹打混勻，冰上放置10 min，800×g、4℃離心5 min，棄上清，用600 μL的裂解緩沖液重懸沉淀，混勻，加入20 g/L的蛋白酶K溶液5 μL，混勻，56℃消化至溶液呈澄清狀。冷卻至室溫，加入5 μL 5 g/L RNase消化30 min，轉入新的1.5 mL EP管。加入等體積的酚 －氯仿溶液(酚∶氯仿∶異戊醇 =25∶24∶1)，劇烈振蕩15 s，室溫靜置 5 min，12000×g、4℃離心 10 min，將上清轉入新的1.5 mL EP管。加入20 μL 5 mol/L 的 NaCl、1 mL 無水乙醇，冰上放置 10 min，12000×g、4℃離心10 min，棄上清。用75%乙醇清洗沉淀2次 ，室溫放置自然風干，200 μL純水溶解沉淀得到DNA樣品。超聲處理DNA樣品，加入5'－甲基胞嘧啶抗體，4℃、垂直混勻器上孵育過夜;加入磁珠偶聯(lián)Ⅱ抗，4℃、垂直混勻器上孵育2 h;用1 mL預冷的溶液［2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris(pH 8.0)，1%Triton X － 100，0.1%SDS，150 mmol/L NaCl］洗滌3－5 min，然后將EP管放到磁力架上，放置10 min直至磁珠全部被吸附到管壁上，棄上清;洗脫的DNA純化后對各樣品的目的基因和對照(input)分別進行real－time PCR反應。設計陽性基因擴增引物序列如下，F(xiàn)CRL4基因:5'－AGTTTGATTAATATGGCGAAATTTC － 3'，5'－ TAACCAAAAAACTCCTAACCTCGTA －3'，141 bp;SERPINB7 基因:5'－TTTGTTAGAAATGTAAATGTTGGTC － 3'，5'－ ATAATCTCGATCTCCTAACCTCGTA －3'，107 bp;MBP 基因:5'－TTTGGTTATGAGGAAGAGAATTTAC －3'，5'－TCTAAAACTACCACACATTACCGAT －3'，200 bp;PTPRN2基因:5'－TGATTTAGATTATAAATTAATTATTCG － 3'，5'－ ATAATAAAAAACGAACGCGAA －3'，137 bp。測定標準曲線和熔解曲線，確保擴增的準確性和專一性，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，采用 2－ΔΔCt法［5］進行分析。

8 統(tǒng)計學處理

SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析采用 2－ΔΔCt法處理得出的數(shù)據(jù)。每部分的熒光定量PCR均進行3次實驗，相對定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差()表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。

結 果

1 CpG島芯片數(shù)據(jù)分析

與健康對照組相比，IgAN患者組總體的H3K4三甲基化水平升高，甲基化比率為0.626±0.050 vs 0.351 ±0.024(P ＜0.05)，見圖 1。使用 GenePix 4000B芯片掃描儀配套軟件計算所有基因的Cy3/Cy5值(ratio值)，篩選Ratio值＞2的所有數(shù)據(jù)項，獲得組蛋白H3K4三甲基化(H3K4me3)靶點圖譜。結果顯示321條探針H3K4me3出現(xiàn)顯著差異，其中154條探針顯示為H3K4me3水平升高，167條探針顯示H3K4me3水平下調(diào)，共涉及到83個基因。表1中列舉了20個H3K4me3水平上調(diào)或下降的基因。比較IgAN患者與健康者之間組蛋白H3K4三甲基化的差異，根據(jù)ChIP－chip的結果，我們選擇2個H3K4三甲基化水平增高的基因(FCRL4和SERPINB7)和2個H3K4三甲基化水平降低的基因(PTPRN2和MBP)進行下一步的研究。

Figure 1.The levels of histone H3 lysine 4 trimethylation and DNA methylation in IgAN patients.*P ＜0.05 vs control.圖1 IgAN患者總體H3K4三甲基化和DNA甲基化水平

表1 CpG島芯片IgA腎病患者與健康對照之間2倍以上和以下改變的H3K4me3基因Table 1.The 20 selected genes with H3K4me3 alterations between IgAN patients and healthy subjects

2 ChIP－qPCR驗證結果

為了證實CpG島芯片結果的準確性，我們運用熒光定量PCR對免疫沉淀的DNA進行分析。如表2所示，IgAN患者4個基因的熒光定量PCR結果與正常對照之間存在顯著差異(P＜0.05)，與芯片分析結果相一致。

表2 4個陽性基因ChIP－qPCR驗證結果Table 2.The validation results of ChIP－qPCR from the 4 selected genes(.n=40)

表2 4個陽性基因ChIP－qPCR驗證結果Table 2.The validation results of ChIP－qPCR from the 4 selected genes(.n=40)

*P ＜0.05 vs control.

Group FCRL4 SERPINB7 PTPRN2 MBP IgAN 1.72 ±0.03* 2.13 ±0.01* 0.52 ±0.01* 0.31 ±0.03*Control 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00

3 陽性基因mRNA的表達

IgAN患者4個陽性基因的mRNA表達與正常對照之間存在顯著差異(P＜0.05)，見表3。H3K4三甲基化增高的2個基因mRNA表達增加;反之，H3K4三甲基化降低的基因mRNA表達也隨之下降。

表3 4個陽性基因mRNA表達差異Table 3.The mRNA expression of the 4 selected genes(.n=40)

表3 4個陽性基因mRNA表達差異Table 3.The mRNA expression of the 4 selected genes(.n=40)

*P ＜0.05 vs control.

Group FCRL4 SERPINB7 PTPRN2 MBP IgAN 2.04 ±0.05* 1.87 ±0.02* 0.23 ±0.01* 0.48 ±0.05*Control 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00

4 DNA甲基化水平檢測結果

與健康對照組相比，IgAN患者組總的DNA甲基化水平降低，甲基化比率為 0.326±0.016 vs 0.518±0.037(P＜0.05)，見圖1。IgAN 患者4個陽性基因DNA甲基化水平與正常對照之間存在顯著差異(P＜0.05)，F(xiàn)CRL4基因DNA甲基化水平降低，另外3個基因DNA甲基化水平增高，見表4。

表4 4個陽性基因DNA甲基化水平差異Table 4.The DNA methylation levels of the 4 selected genes(.n=40)

表4 4個陽性基因DNA甲基化水平差異Table 4.The DNA methylation levels of the 4 selected genes(.n=40)

*P ＜0.05 vs control.

Group FCRL4 SERPINB7 PTPRN2 MBP IgAN 0.32 ±0.04* 1.96 ±0.04* 2.56 ±0.03* 2.04 ±0.02*0.00 Control 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 1.00 ±

討 論

DNA甲基化和組蛋白修飾是表觀遺傳的兩種主要修飾形式，在進化過程中組蛋白甲基化和DNA甲基化兩者在機能上經(jīng)常聯(lián)系在一起。組蛋白H3K4甲基化可激活基因轉錄，而DNA甲基化則可抑制基因的轉錄［7，8］。

IgAN是以IgA為主的免疫球蛋白彌漫沉積于腎小球系膜區(qū)的一種自身免疫性疾病，我們的實驗結果顯示IgAN病人總體H3K4三甲基化水平升高，基因組DNA甲基化水平降低。我們選擇4個與IgAN致病可能存在關聯(lián)的基因，2個H3K4三甲基化水平增高的基因為FCRL4和SERPINB7，2個H3K4三甲基化水平降低的基因PTPRN2和MBP，探討組蛋白H3K4三甲基化與DNA甲基化之間的關聯(lián)。

FCRL4(Fc receptor－like 4)基因編碼一種免疫球蛋白Fc段受體，它通過激活細胞因子，加劇IgAN的發(fā)展［9］。本研究發(fā)現(xiàn)PBMCs中FCRL4基因的組蛋白H3K4三甲基化水平有顯著增強，DNA甲基化水平降低，mRNA表達水平增高。

PTPRN2(protein tyrosine phosphatase，receptor type，N polypeptide 2)是一種酪氨酸磷酸酶蛋白，可通過抑制酪氨酸激酶而降低腎臟足細胞表達血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，避免腎臟排出過多的蛋白［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，PTPRN2基因H3K4三甲基化水平降低，DNA甲基化水平增高，mRNA表達也顯著降低，提示低濃度的PTPRN2不足以抑制酪氨酸激酶的活性。

甘露醇結合蛋白(mannose－binding protein，MBP)是一種屬于免疫系統(tǒng)的防御分子，是人體與外環(huán)境的首道防線，Zhang等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在反復發(fā)生感染、懷疑有免疫調(diào)理缺陷的動物模型中，MBP血清水平顯著低于正常對照組。我們在IgAN病人中發(fā)現(xiàn)，MBP基因H3K4三甲基化水平降低，DNA甲基化水平增高，同時mRNA表達也顯著降低，提示有可能因此導致IgAN病人體內(nèi)MBP蛋白含量減少，免疫功能紊亂。

上述3個基因中，組蛋白H3K4位點三甲基化修飾和DNA甲基化呈現(xiàn)協(xié)同作用。FCRL4基因H3K4位點三甲基化水平增高，DNA甲基化降低，均促進基因mRNA表達;而MBP和PTPRN2基因H3K4位點三甲基化水平降低，DNA甲基化增高，均抑制基因mRNA 表達。Irvine等［12］和 Okitsu等［13］的研究認為組蛋白在H3K4位點的雙甲基化和DNA甲基化存在協(xié)同作用，從我們的研究結果來看，三甲基化的H3K4位點和DNA甲基化之間同樣存在協(xié)同作用。

然而，SERPINB7(serpin peptidase inhibitor，clade B，member 7)基因的H3K4位點三甲基化和DNA甲基化呈現(xiàn)出矛盾的結果。SERPINB7是絲氨酸蛋白酶抑制劑進化枝B的第7位成員，為近年發(fā)現(xiàn)的特異性表達于腎臟的基因。研究表明，該基因表達產(chǎn)物可以與纖溶酶共價結合而抑制其活性，繼而抑制細胞外基質(extracellular matrix，ECM)降解，參與腎臟纖維化［14］。該基因在正常的腎小球系膜細胞有微弱的表達，而在增殖性腎小球疾病表達明顯增強，本研究結果顯示IgAN患者 SERPINB7基因H3K4三甲基化水平、mRNA表達均顯示為增高，與戴春等［15］的報道相符合。但是，SERPINB7基因DNA甲基化的結果也是明顯增高。可見，SERPINB7基因mRNA表達與組蛋白H3K4me3甲基化修飾作用相同，而與DNA甲基化作用相反。我們推測在IgAN患者PBMCs內(nèi)組蛋白甲基化和DNA甲基化修飾的相互作用過程中，H3K4三甲基化修飾作用可能處于優(yōu)勢地位;也有可能有其它的后天因子參與了SERPINB7基因修飾。這也說明了DNA和組蛋白甲基化修飾效應結果的復雜性，在不同的基因中，甲基化和組蛋白甲基化在基因表達過程中所起的關鍵作用可能不同。

本研究選擇4個與IgAN發(fā)病密切相關的基因，研究組蛋白H3K4三甲基化水平和DNA甲基化水平，結果表明這2種共價修飾都可能參與了IgAN的發(fā)病機制，但其最終機制仍需要將來通過大量的基因檢測來證實。

［1］Arai E，Kanai Y.Genetic and epigenetic alterations during renal carcinogenesis ［J］.Int J Clin Exp Pathol，2010，4(1):58－73.

［2］袁 敏，沈 南，唐元家，等.DNA甲基化與系統(tǒng)性紅斑狼瘡［J］.中國病理生理雜志，2009，25(11):2217－2220，2224.

［3］Haas M.Histology and immunohistology of IgA nephropathy［J］.J Nephrol，2005，18(6):676 －680.

［4］Wu H，Ji H.JAMIE:joint analysis of multiple ChIP－chip experiments［J］.Bioinformatics，2010，26(15):1864－1870.

［5］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2－ΔΔCtmethod［J］.Methods，2001，25(4):402 －408.

［6］楊淋清，紀衛(wèi)東，陶功華，等.結晶型硫化鎳誘發(fā)細胞惡性轉化過程中基因組總體DNA甲基化的改變［J］.中華預防醫(yī)學雜志，2010，44(7):622 －625.

［7］Shindo N.Histone modification:a new era of targeting epigenetics［J］.Rinsho Ketsueki，2009，50(4):282 － 288.

［8］楊祖立，康 亮，黃美近，等.結直腸癌細胞中脾酪氨酸激酶基因甲基化狀態(tài)和表達的關系［J］.中國病理生理雜志，2008，24(9):1720 －1725.

［9］Kanamaru Y，Arcos－ Fajardo M，Moura IC，et al.Fc alpha receptor I activation induces leukocyte recruitment and promotes aggravation of glomerulonephritis through the FcR gamma adaptor［J］.Eur J Immunol，2007，37(4):1116－1128.

［10］Bukowski RM.Tyrosine kinase inhibitors in advanced renal cell carcinoma:the evolving treatment paradigm［J］.Clin Genitourin Cancer，2009，7(1):9 －10.

［11］Zhang L，Ye F，He Y，et a1.Establishment of a mouse IgA nephropathy model with the MBP－20－peptide fusion protein［J］.Anat Rec(Hoboken)，2010 ，293(10):1729－1737.

［12］Irvine RA，Lin IG，Hsieh CL.DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation［J］.Mol Cell Bid，2002，22(19):6689 －6696.

［13］Okitsu CY，Hsieh CL.DNA methylation dictates histone H3K4 methylation ［J］.Mol Cell Biol，2007，27(7):2746－2757.

［14］Li YJ，Du Y，Li CX，et a1.Family － based association study showing that immunoglobulin A nephropathy is associated with the polymorphisms 2093C and 2180T in the 3'untranslated region of the megsin gene［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15(7):1739 －1743.

［15］戴 春，郭德森.基因干擾對人腎小球系膜細胞megsin基因表達及α平滑肌肌動蛋白和轉化生長因子β1生成的影響［J］.中華腎臟病雜志，2008，24(2):140－141.