尹明景，溫漢春，葉永維，管慶林，黃皓章，黃露霜，朱繼金△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1急診科，2心血管病研究所，廣西 南寧 530021)

大量臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料表明高血壓、高血脂是人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的最主要危險(xiǎn)因素，高鈉鹽高脂肪飲食則是被證明是最重要的導(dǎo)致血管粥樣硬化的環(huán)境因素［1－2］。CD40系統(tǒng)的相互作用作為炎癥信號(hào)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展、變化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3－4］。他汀類(lèi)藥物被證明有穩(wěn)定AS的斑塊等多重效應(yīng)作用而廣泛使用于治療高膽固醇血癥和冠心病［5－6］。本研究通過(guò)利用高鹽和高脂肪攝入模擬導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的最重要的環(huán)境因素，觀(guān)察動(dòng)脈血壓、血脂、血清可溶性 CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40L)濃度、動(dòng)脈組織CD40/CD40L表達(dá)強(qiáng)度以及血管構(gòu)型參數(shù)變化情況和他汀類(lèi)藥物對(duì)這一過(guò)程的影響，以探討動(dòng)脈粥樣硬化及他汀類(lèi)藥物的治療效果和機(jī)制。

材料和方法

1 試劑與主要設(shè)備

1.1 主要試劑 膽酸鈉片購(gòu)于上海實(shí)業(yè)聯(lián)合集團(tuán)長(zhǎng)城藥業(yè)有限公司;膽固醇購(gòu)于天津光夏精細(xì)化工研究所;維生素D3注射液購(gòu)于浙江仙據(jù)制藥股份有限公司;辛伐他汀片購(gòu)于江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司;蘇木素購(gòu)于福州邁新生物科技開(kāi)發(fā)有限公司;油紅O購(gòu)于上海銳聰科技發(fā)展有限公司;大鼠sCD40L ELISA試劑盒購(gòu)于上海玉博生物科技有限公司;兔抗大鼠CD40L單克隆抗體購(gòu)自上海玉博生物科技公司;羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗購(gòu)自上海玉博生物科技公司。

1.2 主要設(shè)備 鼠尾血壓計(jì)測(cè)量系統(tǒng)(北京奧爾森特科技有限公司);病理組織切片機(jī)(Leitz，1512型);Olympus Vanox顯微鏡照相系統(tǒng)(Optical Co.Ltd);圖像分析儀(Leica，DMR+0550型);貝克曼全自動(dòng)生化儀與血液生化指標(biāo)檢測(cè)(貝克曼庫(kù)爾特公司，廣西醫(yī)科大學(xué)一附院臨床檢驗(yàn)中心完成);酶標(biāo)儀(伯樂(lè)牌全自動(dòng)酶標(biāo)儀，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

2 動(dòng)物模型的建立

2.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng) 雄性SD成年大鼠60只，體重200～250 g，清潔級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)2周后按隨機(jī)分組法分為5組(n=12):正常對(duì)照組(normal，N組)、高脂攝入組(high fat group，F(xiàn) 組)、高鹽組(high salt group，S組)、高鹽高脂組(SF組)和高鹽高脂加辛伐他汀組(T組)。大鼠同置于相對(duì)恒溫(25℃)、恒濕(75%)房間，飲水、飼料不限，繼續(xù)喂養(yǎng)16周。飼料配方:N組:標(biāo)準(zhǔn)飼料，每100 g含食鹽0.4%;F組:標(biāo)準(zhǔn)飼料添加10%蛋黃粉、0.3%膽酸、5%豬油、1.2%膽固醇，在3 d內(nèi)腹腔注射7×105IU/kg的總劑量的維生素D3;S組:在標(biāo)準(zhǔn)飼料中加入4%的食用鹽;SF組:高脂配方中添加4%食用鹽;T組:高鹽與高脂飼料配方中加入辛伐他汀2 mg/kg。所有飼料由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制和提供。

2.2 血壓測(cè)量 動(dòng)物飼養(yǎng)16周后，使用北京奧爾森特科技有限公司無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓計(jì)測(cè)量系統(tǒng)，記錄每只大鼠鼠尾動(dòng)脈血壓(收縮壓)，每只測(cè)4～6次，取平均值。

2.3 組織取材與數(shù)據(jù)的測(cè)量

檢測(cè)血壓后，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，開(kāi)腹后從下腔靜脈穿刺取血，離心分離血清，置于－20℃保存，用于檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)及sCD40L濃度。

剖開(kāi)大鼠胸腔與腹腔，完整切取動(dòng)脈瓣上主動(dòng)脈起始部至髂動(dòng)脈分叉處的主動(dòng)脈，長(zhǎng)度約3 cm左右。先取主動(dòng)脈瓣上血管以10 μm厚度連續(xù)石蠟切片，取切片進(jìn)行免疫組化染色、油紅O染色和常規(guī)蘇木精－伊紅染色。免疫組化染色圖片利用病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行形態(tài)參數(shù)和吸光度測(cè)量，顯示染色強(qiáng)度和含量，將結(jié)果按強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性進(jìn)行分級(jí)。油紅O染色顯示動(dòng)脈組織脂肪浸潤(rùn)情況;HE染色將動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜與外膜顯色清楚。將動(dòng)脈環(huán)的切片置于顯微鏡下，放大倍數(shù)為40倍使之包括完整的動(dòng)脈環(huán)并將圖像用攝影鏡頭傳輸?shù)轿C(jī)顯示屏上，鼠標(biāo)描出動(dòng)脈環(huán)的內(nèi)腔和外環(huán)(不包括外膜外的結(jié)締組織)的完整輪廓，用Leica分析軟件平面法，計(jì)算出血管內(nèi)腔面積和血管橫斷面積，并由此計(jì)算兩者的比值和中膜的厚度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情況

動(dòng)物喂養(yǎng)期間，共喂養(yǎng)60只大鼠，存活55只，高鹽高脂組死亡3只，死于肺部感染;單純高脂組死亡1只，辛伐他汀干預(yù)組死亡1只，經(jīng)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病因。

2 各組大鼠干預(yù)后血壓與體重的變化

F組和SF大鼠體重明顯增加(P＜0.01)，而S組和T組與N組無(wú)明顯差異。S組與F組血壓均超過(guò)正常水平(P＜0.01)，SF組血壓增高更明顯(與F組或S組比，P＜0.01)。T組較 SF組血壓有所下降，但未能降至正常水平，與單一因素干預(yù)組無(wú)明顯差異，見(jiàn)表1。

3 各組大鼠血脂的變化

SF組TC和TG較其它組明顯升高(P＜0.01);F組TC和TG較N組亦明顯升高(P＜0.01);而S組TG未見(jiàn)明顯改變;N組與T組之間無(wú)明顯差異，見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠收縮壓和體重Table 1.Systolic blood pressure(SBP)and body weight(BW)of rats in each group()

表1 各組大鼠收縮壓和體重Table 1.Systolic blood pressure(SBP)and body weight(BW)of rats in each group()

△△P ＜0.01 vs N group;##P ＜0.01 vs SF group.N:control;S:high salt;F:high fat;SF:high salt+high fat;T:high salt+high fat+simvastatin.

344.5 ±27.6 N 12 128.0 ±13.2 354.8 ±39.2 S 12 156.4 ±18.0△△## 361.1 ±25.6 F 10 148.9 ±27.3△△## 390.9 ±35.6△△SF 10 170.5 ±14.8△△ 412.3 ±45.6△△T 11 154.4 ±13.1△△

表2 各組大鼠血脂Table 2.Serum lipids in rats(mmol/L.)

表2 各組大鼠血脂Table 2.Serum lipids in rats(mmol/L.)

△△P ＜0.01 vs N group;＊＊P ＜0.01 vs SF group.

Total cholesterol Triglycerides Group n

4 各組大鼠血清sCD40L濃度

S組、F組和SF組血清sCD40L濃度高于N組和T組(P＜0.05);SF組血清sCD40L濃度高于S組和F組(P＜0.05);S組與F組間差異無(wú)顯著(P＞0.05);而N組與T組間差異亦無(wú)顯著(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清sCD40L濃度Table 3.The serum concentration of sCD40L(ng/L.)

表3 各組大鼠血清sCD40L濃度Table 3.The serum concentration of sCD40L(ng/L.)

△P ＜0.05 vs N group;#P ＜0.05 vs SF group.

N 12 2306.86 ±256.86 S 12 3271.24 ±282.11△#F 10 3452.69 ±320.79△#SF 10 4341.21 ±365.19△11 2279.40 ±299.75 T

5 動(dòng)脈組織CD40/CD40L表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，N組和T組無(wú)明顯著色，胞核清晰;S組和F組呈弱陽(yáng)性，藍(lán)褐色較淡;SF組染色明顯加深，呈暗藍(lán)褐色，見(jiàn)圖1。

采用Kruskal－Wallis秩和檢驗(yàn)對(duì)各組的陽(yáng)性率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示升主動(dòng)脈起始段動(dòng)脈組織CD40/CD40L表達(dá)強(qiáng)度:S組、F組和SF組高于N組和T組(P＜0.05)，且SF組高于S組和F組(P＜0.05)，S組與F組、N組與T組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)表 4。

Figure 1.Immunohistochemical staining of CD40/CD40L(×100).A:control group;B:high salt group;C:high fat group;D:high fat+high salt group;E:high salt+high fat+simvastatin group.圖1 各組免疫組化染色結(jié)果

表4 各組大鼠動(dòng)脈組織CD40/CD40L表達(dá)強(qiáng)度Table 4.CD40/CD40L expression in arterial tissues

6 各組大鼠動(dòng)脈構(gòu)型的變化

各組大鼠動(dòng)脈構(gòu)型的變化與N組相比，S組動(dòng)脈中膜明顯增厚，但血管內(nèi)膜完整，管壁厚度均勻一致，血管內(nèi)腔面積和血管橫斷面積均增加;高脂組攝入也存在類(lèi)似改變，但管壁厚薄不均，有明顯斑塊形成，形態(tài)不規(guī)則，蘇木素－油紅O染色在高倍鏡下為紫紅色中膜層見(jiàn)桔紅色的脂肪浸潤(rùn)，血管內(nèi)腔明顯變窄;SF組的這種改變更為明顯，且使血管內(nèi)腔面積與血管橫斷面積的比值明顯縮小;而辛伐他汀治療組未見(jiàn)明顯動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和脂肪浸潤(rùn)，僅表現(xiàn)為中膜增厚，見(jiàn)表 5、圖 2、3。

Figure 2.Configurational changes of aorta(HE staining，×40).A:control group;B:high salt group;C:high fat group;D:high fat+high salt group;E:high salt+high fat+simvastatin group.圖2 各組大鼠動(dòng)脈構(gòu)型變化

Figure 3.Configurational changes of aorta(oil red O staining，×100).A:control group;B:high salt group;C:high fat group;D:high fat+high salt group;E:simvastatin group.圖3 各組大鼠動(dòng)脈構(gòu)型變化

表5 各組大鼠血管構(gòu)型數(shù)值變化表Table 5.Vessel configuration values in each group()

表5 各組大鼠血管構(gòu)型數(shù)值變化表Table 5.Vessel configuration values in each group()

△△P ＜0.01 vs N group;#P ＜0.05 vs N group.MT:medium thickness;LA:lumen area;TVA:total vascular area.

Group MT(μm) LA(mm2) TVA(mm2) LA/TVA(%)N 93.81 ±10.48 2.63±0.58 3.31±0.59 79.30 ±5.52 S 135.28±12.29△△ 2.75±0.52 3.59±0.47# 72.90±4.90#F 158.86±15.23△△ 2.58±0.63 3.52±0.72# 70.00±6.77#SF 184.00±13.40△△ 2.87±0.41 4.33±0.60△△ 66.70±6.91△△T 112.60 ±15.73 2.87±0.48 3.80±0.58# 74.50 ±7.26#

討 論

本研究通過(guò)高脂和高鈉鹽攝入干預(yù)普通SD大鼠16周后，高鹽組或高脂組的大鼠血壓明顯高于正常組，動(dòng)脈結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯增厚甚至粥樣硬化等病理變化，這種異?，F(xiàn)象在高鈉鹽與高脂肪復(fù)合喂養(yǎng)組大鼠比任何單一因素喂養(yǎng)顯著，而且血脂增高與血壓呈正相關(guān)，提示高脂可能有加重高鹽飲食所致大鼠動(dòng)脈血壓效應(yīng)，兩種因素在誘發(fā)血管病變方面可能有協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高鹽喂養(yǎng)大鼠發(fā)生動(dòng)脈中膜增厚明顯但均勻一致、血管內(nèi)膜完整，血管和管腔面積均增加，血管橫斷面積和血管內(nèi)腔面積均有明顯的增大，但由于在中膜增厚的情況下，血管內(nèi)腔面積/血管橫斷面積比例較正常變小，存在著所謂外向型重構(gòu)現(xiàn)象，但未出現(xiàn)典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，提示血管壁平滑肌增生導(dǎo)致中膜增厚和功能異常改變可能是高鈉鹽誘發(fā)高血壓關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另一方面，本研究中發(fā)現(xiàn)高脂飲食亦誘發(fā)大鼠血壓升高，但其主動(dòng)脈構(gòu)型變化與高鹽攝入組不同，動(dòng)脈中膜明顯增厚但很不均勻且出現(xiàn)典型的動(dòng)脈粥樣斑塊，油紅O染色發(fā)現(xiàn)其動(dòng)脈管壁存在典型脂肪浸潤(rùn)，其血管內(nèi)腔面積/血管橫斷面積比減少更明顯，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高鹽高脂復(fù)合干預(yù)的大鼠，其動(dòng)脈中膜厚度明顯高于正常組與任何單一因素干預(yù)組，動(dòng)脈粥樣硬化改變也更加顯著，提示高鹽與高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致的血管構(gòu)型改變更加嚴(yán)重。根據(jù)上述研究表明，高鹽高脂復(fù)合飲食較任何單一因素均能明顯改變動(dòng)脈構(gòu)型，高鹽飲食對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程存在明顯強(qiáng)化作用。

流行病學(xué)證實(shí)長(zhǎng)期高鹽飲食與一些人群動(dòng)脈血壓升高有一定關(guān)系，其機(jī)制可能是由于鈉潴留使細(xì)胞外液容量增加，因此心排血量增加;血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈉水平增高又導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高，并使血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)，因此外周血管阻力升高;高鹽攝入甚至可以損害血管內(nèi)皮功能和腎臟功能，這些均可促進(jìn)高血壓的形成［7－8］。而高血壓又是AS重要的危險(xiǎn)因素，過(guò)高的血管壁壓力通過(guò)機(jī)械和化學(xué)雙重刺激損傷內(nèi)皮細(xì)胞，加上血流對(duì)血管壁的沖擊會(huì)損害血管內(nèi)膜，內(nèi)皮的功能受到損傷后，血液中的脂質(zhì)更加容易沉積在血管壁，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，促進(jìn)血管中膜平滑肌層向內(nèi)膜遷移，后者合成膠原和細(xì)胞外基質(zhì)并發(fā)生自身增殖，同時(shí)分泌并激活多種細(xì)胞因子吸引循環(huán)中的單核細(xì)胞黏附聚集，遷入內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞 ，后者與SMCs在內(nèi)膜下吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，加速斑塊的形成和內(nèi)膜與中膜的增厚［9－10］。高脂肪攝入可以導(dǎo)致血脂增高、損傷動(dòng)脈內(nèi)膜，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化與血管重構(gòu)，目前公認(rèn)的機(jī)制之一是高膽固醇中富集的氧化修飾LDL(oxLDL)在動(dòng)脈內(nèi)膜受損情況下進(jìn)入內(nèi)膜下中層，吸附血液中的單核細(xì)胞遷入動(dòng)脈內(nèi)膜并轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞［11－12］。在合并高血壓情況下，二者互相促進(jìn)，明顯加劇動(dòng)脈粥樣硬化的形成。而發(fā)生了動(dòng)脈粥樣硬化的血管正常舒張功能減弱，血管壁的僵硬度增加，血壓又會(huì)升高，二者之間互為因果，形成惡性循環(huán)。

本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)辛伐他汀藥物干預(yù)高鹽高脂復(fù)合喂養(yǎng)的大鼠，其動(dòng)脈中膜較正常組輕度增厚，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其血管內(nèi)腔面積/血管橫斷面積比較正常組也無(wú)明顯改變，表明他汀類(lèi)藥物在逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈斑塊與改善血管重構(gòu)的明顯作用。大量實(shí)驗(yàn)研究和大規(guī)模臨床試驗(yàn)也顯示他汀類(lèi)藥物不僅具有調(diào)脂作用，還具有很多獨(dú)立于其調(diào)脂作用的效果，即他汀類(lèi)藥物的多效性，如改善血管內(nèi)皮功能、抑制炎癥及抗氧化反應(yīng)、抗血小板聚集和抑制血栓形成、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊、抑制心肌重塑及心肌細(xì)胞凋亡、抑制心臟電生理重塑及調(diào)節(jié)心臟植物神經(jīng)功能等一系列降脂外作用［13－15］。

研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化是一種有免疫系統(tǒng)參與的慢性炎癥，CD40和CD40配體系統(tǒng)作為重要的炎癥信號(hào)通路是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與斑塊的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［16］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察血清sCD40L表達(dá)水平的變化，作為觀(guān)察炎癥的指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)高鹽組、高脂組、高鹽高脂組血清sCD40L表達(dá)水平較正常組和治療組明顯升高，高鹽高脂組sCD40L表達(dá)水平較高鹽組和高脂組又明顯升高，辛伐他汀治療組與正常組間無(wú)明顯差異，免疫組化檢測(cè)各組大鼠升主動(dòng)脈起始段動(dòng)脈組織CD40/CD40L表達(dá)強(qiáng)度的差異亦與血清sCD40L表達(dá)水平差異類(lèi)似。表明他汀類(lèi)藥物可通過(guò)抑制CD40/CD40L途徑來(lái)保護(hù)動(dòng)脈組織。隨著他汀類(lèi)藥物作用機(jī)制的逐漸明朗和越來(lái)越多的循證醫(yī)學(xué)支持，他汀類(lèi)藥物的應(yīng)用前景將更加廣泛。

以上研究表明，在較短時(shí)間予高鹽高脂飲食可以誘導(dǎo)大鼠血壓升高、血脂異常與動(dòng)脈粥樣硬化形成，建立類(lèi)似代謝異常所致的高血壓與動(dòng)脈粥樣硬化模型，他汀類(lèi)藥物不但具有降脂作用，對(duì)大鼠主動(dòng)脈重構(gòu)有明顯抑制作用，提示他汀類(lèi)藥物在防治動(dòng)脈粥樣硬化和治療代謝綜合征方面有重要的作用。

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