彭 花，鄧穗平，談 金，蔣建偉，歐陽健明△

(暨南大學(xué)1生物礦化與結(jié)石病防治研究所，2醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

腎小管上皮細(xì)胞損傷是引起腎結(jié)石形成的重要原因之一。這些細(xì)胞受損后，由于基底膜直接暴露于管液中，有助于微晶的滯留和生長，成為結(jié)晶巢;此外，膜碎片在過飽和管液中還可促使異質(zhì)成核，甚至阻塞腎小管，產(chǎn)生了一個有利于晶體生長的環(huán)境，從而促進(jìn)腎結(jié)石形成［1］。目前對腎石病機(jī)制的研究多采用細(xì)胞模型、動物實驗?zāi)Ｐ秃蜕锬つＰ汀＜?xì)胞模型采用的細(xì)胞系主要有來源于Hampshire豬和美國負(fù)鼠的近曲小管細(xì)胞(LLC－PK1和OK－1)、來源于正常雄性矮腳長耳獵犬腎臟的集合管道和遠(yuǎn)曲小管的細(xì)胞(MDCK－I和MDCK－II)［2］、來源于非洲綠猴和大鼠腎上皮細(xì)胞(BSC－1和NRK－52E)［3］以及犬和鼠腎髓質(zhì)集合管細(xì)胞(RCCD1［2］和IMCD);動物模型多采用誘導(dǎo)鼠腎損傷，建立損傷模型的方法［4］;生物膜模型則采用生物細(xì)胞膜的簡化模擬體系進(jìn)行研究［5］。人類近端腎上皮細(xì)胞來源于人近端腎小管上皮細(xì)胞系(human kidney proximal tubule epithelial cell line，HKC)。研究表明，草酸、草酸鈣晶體以及自由基對HKC有損傷作用［6］。然而對HKC進(jìn)行損傷，建立確切的損傷細(xì)胞模型還未報道。因此，損傷細(xì)胞模型的建立有助于從病理上研究泌尿系結(jié)石的形成機(jī)制。

材料和方法

1 材料和儀器

1.1 材料 HKC來源于上海長征醫(yī)院。培養(yǎng)液DMEMF12和新生牛血清(Gibco)，青霉素(華北制藥股份有限公司)，鏈霉素(大連美羅大藥廠)，細(xì)胞増生分析試劑盒(CCK－8)(日本同仁化學(xué)研究所)。其它常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器 XL－30型環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM，Philips);倒置熒光顯微鏡(IX51)(奧林巴斯公司);激光共聚焦熒光顯微鏡(510 META DUO SCAN，CARL Zeiss);酶標(biāo)儀(Safire 2，Tecan)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HKC用含10%新生牛血清的DMEM－F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時加入100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。HKC傳代采用胰蛋白酶消化法。細(xì)胞達(dá)80%融合后用37℃的D－Hanks平衡液洗滌2次，加入0.25%胰酶消化液，37℃放置3～5 min后在倒置顯微鏡下觀察消化程度，當(dāng)細(xì)胞變圓，細(xì)胞之間出現(xiàn)孔隙且不再連接成片時，加入含10%新生牛血清的DMEMF12培養(yǎng)液，終止消化，并吹打細(xì)胞脫離瓶壁形成單細(xì)胞懸液。

2.2 細(xì)胞活力檢測 將HKC懸液(濃度1×107cells/L)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1 mL;孵育24 h后加入無血清的DMEM－F12孵育12 h，使細(xì)胞同步化。將孔板上的細(xì)胞分為2組，A組和B組。A組為空白組，只加入無血清培養(yǎng)液;B組為H2O2損傷組，加入含1 mmol/L H2O2的無血清培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行損傷，損傷時間分別為 0、0.5、1、1.5、2 和 3 h。達(dá)到預(yù)定的損傷時間后，將2組細(xì)胞都改用新鮮的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK－8溶液，于37℃下孵育4 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度A值，各個條件下的細(xì)胞平行測定3個重復(fù)孔，然后求A值的平均值，細(xì)胞活力=

2.3 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的檢測 按細(xì)胞濃度為5×107cells/L、500 μL/well將單細(xì)胞懸浮液接種于24孔培養(yǎng)板中。按照上面方法孵育及損傷細(xì)胞后，將細(xì)胞懸浮液移入EP管內(nèi)，在4℃離心10 min。取上清液，采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，用比色法分別在波長為532 nm和550 nm處測定MDA和SOD的吸光度A值。

2.4 細(xì)胞表面骨橋蛋白(osteopontin，OPN)檢測與定量 按細(xì)胞濃度為2×108cells/L、2 mL/well將單細(xì)胞懸浮液接種于6孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞孵育及損傷達(dá)到預(yù)定時間后，吸除所有上清液，用PBS洗3次，每次5 min;加入4%多聚甲醛固定10 min，再用PBS洗3次;加入羊血清封閉20 min，滴加兔抗人OPN抗體(sc－20788，Santa Cruz)(1∶150)，于37 ℃下孵育1 h，PBS洗3次。滴加FITC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(sc－2012，Santa Cruz)(1∶100)，放于暗處，在 37℃下孵育 30 min，PBS充分沖洗3次。使用4'，6－二脒基－2－苯基吲哚(DAPI)封閉液(sc－24941，Santa Cruz)封片。對照組以兔血清代替OPN抗體。于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察熒光。細(xì)胞核為藍(lán)色，骨橋蛋白顯綠色。實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

確定FITC綠色熒光定量條件后，F(xiàn)ITC熒光通道各條件不變(激發(fā)光波長:488 nm)，調(diào)節(jié)視野，拍攝一定數(shù)量的熒光圖片(10張左右)，使每個樣品的圖片中細(xì)胞總量在100個左右，運用Axio Vision Release 4.7軟件(Zeiss)分別計算各個細(xì)胞的熒光吸光度值，使用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計算熒光吸光度平均值。

2.5 細(xì)胞損傷前后形貌觀察 按細(xì)胞濃度為1×108cells/L接種于鋪有蓋玻片的12孔板中，每孔1 mL，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育24 h后，加入無血清的DMEM－F12孵育12 h。吸除培養(yǎng)液，用D－Hanks洗滌細(xì)胞2次。將孔板上的細(xì)胞分為2組:A組為空白組;B組為損傷組，加入含H2O2(1 mmol/L)的無血清培養(yǎng)液。孵育一定時間(0、0.5、1、1.5、2、3 h)后，用PBS洗3次，2.5%的戊二醛于4℃固定24 h。然后于50%、70%、90%、100%乙醇中脫水，再用乙酸異戊酯固定后CO2臨界干燥樣品，噴金處理，掃描電子顯微鏡觀測細(xì)胞形貌及超微結(jié)構(gòu)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。Tukey檢驗分析各實驗組與對照組均數(shù)間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 H2O2對HKC活力的影響

通過檢測H2O2對HKC的增殖抑制作用，確定H2O2對HKC的損傷程度。用1 mmol/L H2O2作用HKC 0.5 h后，細(xì)胞活力為(55.0±4.4)%，表明HKC已經(jīng)發(fā)生明顯的損傷(P＜0.05);作用1 h后，細(xì)胞活力顯著下降到(43.6±3.1)%;隨著H2O2作用時間的延長，對細(xì)胞的損傷進(jìn)一步加劇，細(xì)胞活力進(jìn)一步降低;作用2 h后，HKC活力為(40.0±3.6)%(P ＜0.05)，見圖1。

2 HKC損傷后的MDA含量和SOD活性變化

H2O2作用HKC 0.5 h后，MDA含量從對照組的(0.38±0.03)μmol/L上升到(1.00±0.08)μmol/L(P＜0.05)。隨著作用時間增加，MDA含量增加;當(dāng)作用2 h時，MDA含量達(dá)到最大值(1.48±0.08)μmol/L。

1 mmol/L H2O2作用HKC 0.5 h后，SOD活性明顯降低［(108.3±2.3)×103U/L vs(104.2±2.9)×103U/L，P＜0.05］。隨著H2O2作用細(xì)胞的時間分別增加到1和2 h后，SOD活性分別降至(102.7±2.2)×103U/L和(87.0±2.3)×103U/L(P ＜0.05)，見圖2。

3 HKC損傷后OPN的表達(dá)

正常HKC(0 h)周圍沒有或只有少量的OPN表達(dá)，1 mmol/L H2O2損傷0.5 h、1 h和2 h后，HKC周圍出現(xiàn)大量OPN表達(dá)(P＜0.05)，見圖3。

Figure 1.Cell viability of HKC after exposure to 1 mmol/L H2O2 for different time..n=3.*P＜0.05 vs 0 h.圖1 1 mmol/L H2O2作用HKC不同時間后細(xì)胞活力的變化

Figure 2.Changes of MDA content and SOD activity in HKC after exposure to 1 mmol/L H2O2for different time..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h.圖2 1mmol/L H2O2作用HKC不同時間后MDA含量和SOD活性的變化

Figure 3.Expression of OPN on the surface of HKC after exposurt to 1 mmol/L H2O2for different time..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h.圖3 損傷前后HKC表面OPN的表達(dá)

4 細(xì)胞損傷前后形貌的變化

圖4為正常HKC和1 mmol/L H2O2損傷0.5、1、2 h后細(xì)胞形貌的SEM圖片。正常細(xì)胞形態(tài)飽滿、表面完整光滑，見圖4A;損傷1 h后，細(xì)胞干癟收縮，表面粗糙，其鞭毛、突觸大都斷裂脫落，見圖4C。

討 論

在生物體內(nèi)，腎上皮細(xì)胞在病理情況下通過非酶反應(yīng)與酶促反應(yīng)產(chǎn)生大量氧自由基。而生物膜的主要成分磷脂含有不飽和脂肪酸，氧自由基對這些不飽和脂肪酸中的不飽和鍵具有很高的親和力，從而產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量的多少可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，也間接地反映出細(xì)胞受損傷的程度。雖然自由基會對機(jī)體產(chǎn)生諸多危害，但在一般的條件下人體細(xì)胞內(nèi)也存在著清除自由基的物質(zhì)，如抗氧化酶類，其中SOD是一種主要的抗氧化酶，可對抗氧自由基對細(xì)胞造成的損害。生物體內(nèi)SOD水平的降低意味著生物體抵抗自由基損傷的能力降低，反映機(jī)體受自由基損傷的程度。

Figure 4.SEM images of morphology of normal and injured HKC.A:normal cells;B:injury 0.5 h;C:injury 1 h;D:injury 2 h.Scale bar:5 μm.圖4 損傷前后HKC表面形貌的SEM照片

H2O2雖不是自由基，但它屬于活性氧類，有高反應(yīng)性，可促進(jìn)自由基的生成，引發(fā)生物膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至滲入細(xì)胞內(nèi)部，破壞線粒體和DNA結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞壞死和凋亡［7］。我們的實驗結(jié)果表明，H2O2對HKC的氧化性損傷非常明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖受到影響，細(xì)胞活力下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的釋放量增加，抗氧化酶SOD的水平下降。

從化學(xué)的觀點看，腎結(jié)石的形成與尿液中結(jié)石鹽的高度過飽和、抑制劑或促進(jìn)劑的濃度和活性以及尿路細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷等有關(guān)［8］。HKC受損傷后，細(xì)胞膜表面不但能為初始晶核的形成提供有效位點，而且增強(qiáng)了細(xì)胞膜與礦物質(zhì)的黏附，從而增加了腎結(jié)石形成的危險性［6］。以往研究表明，動物的腎小管上皮細(xì)胞損傷后，一水草酸鈣(calcium oxalate monohydrate，COM)晶體的黏附最大可增加 20 倍［9］;鳥糞石的附著力可增加5～6倍［10］。

正常細(xì)胞表面具有抗晶體黏附作用，當(dāng)細(xì)胞損傷之后，細(xì)胞的表面微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并表達(dá)大量能夠吸引鈣離子和草酸鈣晶體的帶負(fù)電荷的物質(zhì)，如透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)、膠原蛋白、OPN等。其中OPN的相對分子質(zhì)量約為44 kD，約含300個氨基酸殘基，其中帶負(fù)電荷的天冬氨酸與谷氨酸和不帶電的絲氨酸占總氨基酸量的一半。研究表明，溶液中游離的OPN能抑制草酸鈣晶體的成核、生長、聚集和對細(xì)胞的黏附;而細(xì)胞表面聚集的OPN則能促進(jìn)晶體的黏附［11］。我們的實驗結(jié)果顯示，1 mmol/L H2O2損傷 HKC后，細(xì)胞表面表達(dá)了大量的OPN，并在1 h時達(dá)到最大(圖3)。位于細(xì)胞膜上OPN的量越多，促進(jìn)晶體黏附的可能性就越大;而且，損傷后產(chǎn)生的細(xì)胞碎片也可以促進(jìn)晶核的形成。因此，HKC損傷后，可加速并促進(jìn)晶體的生長和黏附，最終導(dǎo)致腎結(jié)石形成。

本文研究了H2O2對培養(yǎng)的HKC的致?lián)p傷作用。HKC損傷后，細(xì)胞活力和SOD濃度下降，MDA含量上升，細(xì)胞膜表面的微絨毛斷裂與脫落，且在膜上表達(dá)能夠黏附尿石礦物的蛋白分子OPN。因此，用1 mmol/L H2O2作用HKC 1 h所建立的氧化損傷模型，有助于從細(xì)胞水平和分子水平上闡明腎結(jié)石形成的病理和形成機(jī)制。

［1］Hsieh N，Shih CH，Chen HY，et al.Effects of Tamm －Horsfall protein on the protection of MCDK cells from oxalate induced free radical injury［J］.Urol Res，2003，31(1):10－16.

［2］Schepers MSJ，van Ballegooijen ES，Bangma CH，et al.Crystals cause acute necrotic cell death in renal proximal tubule cells，but not in collecting tubule cells［J］.Kidney Int，2005，68(4):1543 －1553.

［3］Escobar C，Byer KJ，Khan SR.Naturally produced crystals obtained from kidney stones are less injurious to renal tubular epithelial cells than synthetic crystals［J］.BJU Int，2007，100(4):891 －897.

［4］Hirose M，Yasui T，Okada A，et al.Renal tubular epithelial cell injury and oxidative stress induce calcium oxalate crystal formation in mouse kidney［J］.Int J Urol，2010，17(1):83－93.

［5］Deng SP，Ouyang JM.Induction of circular patterns of calcium oxalate monohydrate by defective monolayers on mica surface［J］.Cryst Growth Des，2009，9(1):82 －87.

［6］Chen SS，Gao XF，Sun YH，et al.Analysis of HK －2 cells exposed to oxalate and calcium oxalate crystals:proteomic insights into the molecular mechanisms of renal injury and stone formation［J］.Urol Res，2010，38(1):7－15.

［7］Li CY，Deng YL，Sun BH.Taurine protected kidney from oxidative injury through mitochondrial－linked pathway in a rat model of nephrolithiasis［J］.Urol Res，2009，37(4):211－220.

［8］談 金，鄧穗平，歐陽健明.HKC細(xì)胞損傷前后對草酸鈣晶體吞噬能力的差異［J］.無機(jī)化學(xué)學(xué)報，2010，26(12):2131－2137.

［9］何家揚，周任遠(yuǎn)，王文章，等.防石多糖對受損膀胱粘膜的保護(hù)作用［J］.臨床泌尿外科雜志，2000，15(11):511－513.

［10］Hedelin H.Uropathogens and urinary tract concretion formation and catheter encrustations［J］.Int J Antimicro A-gents，2002，19(6):484－487.

［11］Wang LJ，Guan XY，Tang RK，et al.Phosphorylation of osteopontin is required for inhibition of calcium oxalate crystallization［J］.J Phys Chem B，2008，112(30):9151－9157.